用ImageProPlus分析免疫组化图片.pptVIP

3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄 与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。 显微镜光源 正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为9V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。 不能通过调整聚光镜光圈的方法减低亮度，这会影响到光学系统分辨率及图象的清晰度。 不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的ND滤光片还行。6%的ND滤光片常导致色彩失真。 如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。 固定显微镜的工作条件 不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。 为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。 必须使用手动控制曝光的相机 对每张照片要使用相同曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。 染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。 各种拍摄条件确定后，就必须使用这个条件一次拍摄完所有的照片。以保证它们的曝光一致。 控制相机曝光时间 要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。 拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。同时背景灰度值也不宜过高。 把空白灰度值调到230以上相当于在分光光度计上调节100%透射。 背景的影响 左图：暗且偏蓝的背景严重影响到了阳性区域的色调。而且降低了黄色象素点的IOD值。这会严重影响分析结果。有的CCD具有手动较正色温的功能，可以较正一下背景色调，但暗背景既使不偏色也是影响分析结果的。 较暗的背景值对分析结果的影响 显著性差异 无显著性差异 扣背景后依然没有显著性差异 注意误差线增大了，依然没有显著性差异 不能使用相机的自动白平衡 自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进行白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不能校正。 最好使用专业CCD拍摄 民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面貌，而且它对每一张照片都使用了不同的拍摄条件。严重影响照片的分析测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。 不能使用自动白平衡校正，但在拍摄前使用手动的白平衡校正背景色彩却是必须的。在拍摄照片时要对相机进行背景色彩校正，使得拍摄出的照片中空白的背景呈白色。这种较正将应用于所有拍摄的照片上，与自动白平衡较正不同。自动白平衡较正是对每一张照片都进行各自不同的色彩较正。 应当把照片存为无损压缩格式TIFF 特别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。 注意那些马赛克 总结拍摄注意事项： 调整显微镜光源亮度（电压9伏），足够白，足够亮。 调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。 确认相机未使用自动白平衡功能。但要使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。 使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件（曝光及白平衡设置）一次拍摄完所有照片。 保存照片为TIFF格式。相素不必太大。 3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片 与photoshop不同，image-pro plus是一个图片分析和定量测量软件。 IPP的功能不是用来美化图片，如果照片效果不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应当准确地反映图片本身的真实测量数据。 3.2.1开始使用IPP IPP的程序界面是典型的windows风格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。 进入IPP后的第一件事就是打开一幅待分析的图片。 将分析图片信息保存到数据库中 在程序中保存分析图片过程信息是保存实验原始数据的基本原则，必须遵守。 将图片信息及图片分析过程及分析的信息存入IPP程序数据库是一种保存实验原始数据的操作。要注意对同一张图片进行同样的操作，由于一些手动的操作无法准确地重复，所以会出现两次同样的测量得到有差异的结果的情况。这也是保存测量结果的理由之一。 3.2.2进行光密度值较正。 光密度值校正 前面曾经说过，电子照片上象素点的强度是以灰度值来定义的，对8bit的数字图象，最亮的白色其灰度值为255。最暗的黑色其灰度值