基因工程第8理章pcr技术.pptVIP

Taq Pwo Long sys 0.9kb 1.1kb 2.9 4.8 6.3 科学出版社 C.W.迪芬巴赫 /G.S德维克斯勒，1998 C．W．Dieflenbach/G.S.Dueksler （5）PCR-mediated mutaginesis(诱变) PCR随机突变 每循环Taq错配率在0.1～2×10-4之间。20-25环后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3,但对于构建一个不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。 原因：普通条件下具较大定向错配即AT对变GC对。 设计出一种致突变PCR法，使错误率达7×10-3，且无倾向性。 ① Mg2+→7mM ② Mn2+→0.5mM ③ 提高dCTT/dTTT到1?M，促进错误掺入 ④ 提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位 置继续延伸 PCR定点诱变 见“定点诱变”章节 （6）PCR detection and diognosis 普通诊断 以一对引物或几对引物，加以对照， 检测样品中的DNA的存在 医疗，商品，法医 等位基因鉴定 若多个相似基因共存，设计一系列引物对其进行鉴定，如 Bt crystal protein genes (7) Molecular markers RAPD 随机扩增多态性DNA Random amplified polymorphic DNA AFLP 扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism SSR simple sequence repeat 又称 微卫星DNA（ Microsatellite DNA） 短串联重复序列（Short tandem repeats, STR） (8) RT-PCR 反转录酶PCR reverse transcriptase PCR mRNA----first strand of cDNA 随机引物，如6碱基成对引物，单个18碱基引物 (cDNA合成，单一引物） (10) PCR sequencing (9) Restriction-site PCR For gene walking * Chapter 8 PCR technology PCR polymerase chain reaction Another cloning method Selective amplification of a DNA sequence. In some situation, it essentially replaces traditional cloning methodology. PCR principle PCR: A technique to selectively amplify a specific region of DNA. A method like DNA replication in vivo. ·template：ssDNA or dsDNA ·primers：oligo-nucleotides ·substrates: dNTP ·DNA polymerase: Taq poly ? Basic principle：DNA thynthesing template/primer/DNA poly ? Application: themal-resistance DNA polymerase DNA amplification Principle dATP dGTP dCTP dTTP Mg2+ buffer 5 3 3 5 template primer DNA polymerase denature annealing extension dsDNA ssDAN 92-96?C 37-72 ?C 50-58 ?C 72 ?C 3．Reaction PCR reaction mixture 1．缓冲液 buffer (1×) 50Mm (大于500bp) (70-100Mm , 小于500bp) KCl 引物退火 annealing 10mM Tris·HCl pH 8.3-9.0 1.5mM MgCl2 (0.5-2.5) Stored in 20℃ 2. dNTP Fi