救脑宁注射液治都疗实验性脑血肿家兔的作用及其机制分析.docx

中文摘要中文摘要 中文摘要 中文摘要 出血性中风多发生在中、老年高血压病人，是一种常见、多发病，由于其高病死率、 高致残率，严重危害人类健康。近年来，大量文献显示，人们对缺血再灌注损伤所致的缺 血性中风研究较多，而对出血性中风研究相对较少。本研究是在我们已往多年的工作基础 上，以活血化瘀、清热解毒、化痰开窍法方药一救脑宁注射液为基础，以脑血肿周围损伤 组织的神经细胞凋亡变化为切入点，从整体、细胞、分子、基因水平深入探讨中医药对实 验性脑血肿以及原代神经细胞拟缺血再灌注损伤的保护作用，这将对指导中医临床及深入 研究中医药有效方剂的作用机制提供实验依据。 本论文包括三部分： (1)救脑宁注射液对实验性脑血肿家兔治疗作用的研究：复制 家兔实验性脑血肿模型，观察脑组织病理学变化的演变规律，以及救脑宁注射液的治疗效 应； (2)救脑宁注射液对缺血再灌注诱导原代神经细胞损伤的影响：在体外培养神经细 胞拟缺血再灌注损伤模型上，观察救脑宁注射液抗损伤作用的细胞代谢、形态学与凋亡变 化； (3)救脑宁注射液改善缺血再灌注所致原代神经细胞凋亡及其调控机制的研究：从 细胞、分子、基因水平，在原代神经细胞拟缺血再灌注损伤模型基础上，试图从凋亡发生 的两条主要途径：线粒体途径和死亡受体途径、Caspase一3蛋白酶级联反应以及相关的上 游调控基因等方面阐明救脑宁注射液抗神经细胞凋亡的作用环节与机制。 家兔脑血肿整体动物实验分为六组：正常对照组(Contr01)，模型组(Model)，救 脑宁高剂量组(JNN—H)，中剂量组(JNN-M)，低剂量组(JNN—L)和清开灵注射液组 (QKL)。实验各组分别在造模后3、7、15天(d)取材，观察动物一般情况、脑系数、 脑组织含水量、脑组织HE、Ni SSl’S、Mallory染色、投射电镜形态学变化以及TUNEL染色 显示凋亡细胞等指标变化，并采用计算机图像分析系统对相关形态学指标进行定量分析。 体外培养神经细胞拟缺血再灌注损伤实验也同样分为上述六组即：Control，Model， JNN_H，JNN-M，JNN-L，QKL。实验各组分别于单纯缺血2小时(h)及缺血2h+再灌注4h 取材，检测细胞代谢率(MTT)、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、细胞凋亡率(流式细胞技 术)、形态学、细胞DNA和RNA变化(Ao染色)、线粒体膜电位(流式细胞技术)、细 胞内pH值(流式细胞技术)、细胞内bc卜2／bax、Fas／FasL、Caspase-3蛋白的表达以及 RT-PcR检测bcl一2／bax mRNA表达等指标变化，用计算机图像分析系统对相关指标进行定 量分析。 主要实验结果如下： 1．救脑宁注射液可改善实验性脑血肿家兔一般状态，减轻脑水肿及病理组织学变 化，抑制凋亡发生 实验动物造模后，健侧(左侧)肌力下降，尤以前肢为重，行走病侧(右侧)偏转步 态，以术后7—9天内明显；造模后3、7、1 5天，分别出现不同程度的脑水肿、脑组织含 水量增加，以3、7天为重；脑组织病理形态学观察可见： (1)造模3天时，脑组织以广 泛的细胞与间质水肿和出血为重，神经细胞不同程度的变性、坏死； (2)造模7天时， 脑组织水肿仍较明显，出血现象有不同程度的改善，血肿周围脑组织出现明显的炎细胞反 应与胶质增生现象，可见少量格子细胞； (3)造模15天时，从脑组织形态学变化上看， 救脑宁注射液治疗实验性脑血肿家兔的作用及其机制研究脑组织水肿已不十分明显，出血现象也有减轻，血肿周围脑组织的胶质反应性增生及炎细 救脑宁注射液治疗实验性脑血肿家兔的作用及其机制研究 脑组织水肿已不十分明显，出血现象也有减轻，血肿周围脑组织的胶质反应性增生及炎细 胞浸润现象更加明显，并可见较多的格子细胞，血肿有明显的吸收表现。脑组织TUNEL染 色，造模后皆有明显的阳性深染细胞出现，但以7天时凋亡表现最重。 救脑宁注射液高、中、低剂量组，在各取材时问点表现出不同程度地减小血肿面积， 减轻脑组织含水量及血肿周围组织出血、水肿现象；TUNEL染色显示，神经细胞凋亡阳性 细胞数明显少于相同时间点的模型组；从三种用药剂量对各指标的作用效果来看，以中剂 量作用更好一些，其与清开灵的药效作用相比，要么相似要么更佳。 2．救脑宁注射液有不同程度地提高神经细胞代谢率及DNA、RNA含量，降低LDH漏出 率与凋亡率，改善缺血再灌注致形态学异常变化 神经细胞造模后，细胞代谢率MTT明显下降，LDH漏出率、凋亡率明显升高，与正常 对照组比较p0．05；形态学表现为： (1)倒置相差显微镜：可见有的细胞体积变大，轮 廓不清，光晕不明显，突起肿胀、断裂或短缩。而有的细胞则体积缩小，颜色加深，光晕 消失；(2)普通光学显微镜：HE染色，神经元的数目较正常对照组明显减少，神经元突 起形成的网络明显