苗药含药血清干预家兔软骨细胞的机制探讨-针灸推拿学专业论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 目 目 录 中文摘要 ．1 英文摘要Abstract ．3 引 言 ．6 第一部分实验 8 1．实验材料与方法 8 1．1-实验材料 ．8 1．1．1．实验动物 ．．8 1．1．2．实验主要试剂 ．8 1．1．3．主要实验设仪器及设备 ．．9 1．1．4．主要实验药物 10 1．2．实验方法 10 1．2．1含血清的制备 ．10 1．2．2家兔软骨细胞的体外培养与鉴定 10 1．2．3．MTT法检测苗药含药血清对软骨细胞的增值 ．．12 1．2．4基因芯片检测 12 1．3．数据提取及分析 18 2．实验结果 ．。18 2．1．倒置显微镜观察家兔软骨细胞的生长情况及形态 18 2．2软骨细胞鉴定 ．．18 2．3．硼fT法检测苗药含药血清对软骨细胞增殖的影响 18 2．4．软骨细胞RNA提取的结果 ．19 2．5．聚类分析结果 ．．20 2．6．芯片杂交散点图 20 2．7．I)EG总体分析结果 ．．20 3．讨论 22 3．1研究病种的分析 ．22 3．2．研究方法的分析 25 3．3．实验模型分析 ．．27 3．4．家兔关节软骨细胞的分离、培养、鉴定 ．28 3．5．制各苗药熏蒸组方含药血清的理论 28 3．6．基因芯片结果分析 ．29 第二部分实验 一35 万方数据 1．实验材料与方法 1．实验材料与方法 ．35 1．1．实验材料 ．35 1．1．1主要实验试剂 ．．35 1．1．2主要实验仪器与设备 ．36 1．2基因的选择和引物的设计 ．36 1．3实验过程 ．36 1．3．1．total RNA．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36 1．3．2．DNase I消化处理 ．．37 1．3．3．DNase I消化产物纯化 ．37 1．3．4．Total RNA纯化结果 38 1．3．5．Total RNA消化效果验证 ．．38 1．3．6．total RNA逆转录 ．．39 1．3．7．RealTime PCR产物电泳检测扩增特异性 ．．40 1．4．统计方法 ．40 2．实验结果 41 3．讨论 ．42 4．结论 ．44 总结与展望 ．45 参考文献 46 附 录 49 附录一英文缩略语 49 附录二综 述 ．．50 附录三相关实验图片 ．60 致 谢 79 个人简介 80 万方数据 贵阳中医学院硕士学位论文中文摘要 贵阳中医学院硕士学位论文 中文摘要 目的：膝骨关节炎(KoA)是中老年人常见的致残率较高的疾患之一，由于关节软 骨的退变是不可逆的，导致了KOA的治疗也成为世界医学的难题。本实验以苗 药组方熏蒸治疗为基础，利用基因芯片技术研究该组方对家兔软骨细胞的影响， 进一步从分子水平探讨该方治疗膝骨关节炎的作用机制，以期为临床用药提供 理论依据。 方法： 1．采用“胰蛋白酶一II型胶原蛋白酶消化法培养家兔软骨细胞并检测其细 胞的增殖，应用基因芯片检测被苗药熏蒸组方含药血清干预过的软骨细胞基因表 达的变化。 2．在分析了基因表达谱的结果基础后，进一步采用RealTime RT-PCR技术观 察该苗药熏蒸组方含药血清对软骨细胞中TNFAIP6、IER3、PTGS2基因的表达。 结果： 1．采用“胰蛋白酶一Ⅱ型胶原蛋白酶”消化法培养家兔软骨细胞体系，在倒 置显微镜下观察见FO代软骨细胞呈圆形，悬浮在培养基中。接种24h后，大部分 软骨细胞开始贴壁。36h后开始形成“足样突起，外观呈三角形及不规则形，胞 质丰富，胞核呈圆形。2天后，胞核清晰，有1-3个核仁，细胞增殖速度加快。1 周后，细胞铺满整个瓶底，细胞周围可见具有折光性的细胞外基质，细胞呈典型的 “铺路石样外观。F2、F3代软骨细胞生长增殖速度较其他代好，分泌功能较 强。F4代以后细胞的分泌和增殖能力会逐渐减弱。F2代软骨细胞在12h后开始 贴壁，增殖速度较快，4-5天细胞就能长满瓶底。细胞鉴定：甲苯胺蓝染色后见 软骨细胞胞浆被染成了深蓝色，可见蓝色紫色的异染颗粒细胞核被染成紫色。细 胞传至F4代后，分泌和合成能力减弱，粘多糖的含量会减少，F5代的胞浆内蓝 色颗粒明显减少颜色变浅。MTT法检测以10％含药血清对软骨细胞刺激48h为细 胞最佳增殖点。 2．基因芯片表达谱的结果显示：模型组与正常组相比较，样品的杂交荧光信 号中共有348个表达差异显著的基因，有221个基因表达上调，有128个基因的 表达下调；苗药熏蒸组与模型组相比较，样品中有726个表达差异显著的基因， 有210个基因表达上调，有516个基因的表达下调，清水熏蒸组与苗药熏蒸组相 万方数据 贵阳中医学院硕士学位论文比较；样品中共有 贵阳中医学院硕士学位论文 比较；样品中共有388个表达差异显著的基因，有11