生物化来学实验目的基因的表达.pptVIP

目的基因的表达  原核生物基因结构和表达特点 1.原核生物的染色体DNA是裸露的环形DNA,其转录和翻译是偶联的连续进行。 2.原核生物形成多顺反子mRNA,mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译成多条肽链。 3.一般不含有内含子，没有转录及翻译后加工系统。 4.原核生物中功能相关的基因串联在一起形成操纵子。 原核生物中参与转录和翻译的重要元件 1.启动子 2.终止子 3.SD序列（shine-dalgarno） 4.还有一些其它的调控元件如增强子，衰减子，绝缘子，反义RNA等等也影响着基因的转译。 外源基因在原核表达系统中表达的必要条件 1.删除内含子和5’非编码区； 2.外源基因置于强启动子和SD序列控制下； 3.维持正确的开放阅读框（ORF） 4.mRNA稳定且可以有效转译，形成的蛋白质不易被降解 影响基因在原核细胞中表达效率的因素： 1.启动子：建立表达载体的时候，选择强启动子。 常见的原核强启动子： (1) Plac: 受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导； (2) Ptrp: 取自大肠杆菌色氨酸操纵子； (3) Ptac: Lac启动子和trp启动子的杂合启动子； (4) PL和PR: 噬菌体早期左/右启动子，受λ噬菌体CI基因 负调控，温度诱导 (5) T7启动子。 2. 基因剂量 :带目的基因载体的拷贝数。 3. 核糖体结合位点 (1) SD顺序与16srRNA3’末端互补程度； (2) AUG—SD间的距离 4. 密码子的选用 不同生物甚至同种生物的不同蛋白质的基因对简并密码子的使用具有一定的选 择性。 原核表达载体 1. 原核表达载体所需的主要元件 (1) 启动子；(2) SD顺序; (3) 筛选标记；(4) 其它调控基因 (5) 终止子 (6) 复制原点 (7)MCS 2. 原核表达载体的类型 (1) 融合型表达载体——表达出融合蛋白； (2) 非融合型表达载体——表达出完整蛋白； (3) 分泌型表达载体——表达产物可跨膜分泌到胞间隙。 融合型表达载体 非融合型表达载体 分泌型表达载体 关于载体 PET-21b  PET载体在宿主菌BL21中的调控表达 常见的表达受体菌株 外源基因在大肠杆菌中的表达形式 外源基因在大肠杆菌中的表达产物可能存在于细胞质中、细胞周质和细 胞外培养基中，其表达形式包括形成不溶性蛋白和可溶性蛋白。 1. 包涵体。 具有正确的氨基酸顺序，空间构象错误，一般无生物学活性。 2.融合蛋白。外源蛋白在菌体自身蛋白的引导下正确折叠，形成杂合构象，具有一定的生物学活性。 3. 寡聚型外源蛋白 。外源基因连接在一起克隆在低拷贝的载体上。 4. 整合型外源蛋白。外源基因通过同源交换的方式整合在宿主菌染色体上， 5. 分泌型外源蛋白。 表达产物的检测 1. 特异性鉴定： (1) 荧光抗体法 (2) 免疫沉淀法 (3) westhern印迹法 (4) 酶联免疫吸附法（ELISA） (5) 固相放射性免疫测定法 (RIA) 2 生物学活性测定 基因表达产物的生物学活性测定在某些情况下不需要对表达产物进行纯化，但为了商业化或者是要得到较纯的外源基因表达产物，则需要对表达产物进行纯化，可以大大提高酶的比活力。 细胞的破碎 离心 SDS如需要进一步纯化表达蛋白就要通过一些生化的方法如浓缩法，柱层析法分别进行初步分离和进一步的分离纯化 GSTs的生物学活性测定 CHO-COOH + PHC 铁氰化钾发色的苯肼物 * * P SD Foreign DNA 融合型表达载体 融合基因 P SD Foreign DNA P SD 融合型表达载体 融合基因 Foreign DNA IPP Plac, Ptac RB791 PL M5219 T7 HMS174 T7 BL 21 表达载体启动子 宿主菌株