杂交水稻分的扩增.pptVIP

杂交水稻种子纯度的鉴定 ;传统的种子 纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯 度鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被成功地引入到种子纯度的鉴定中，如分子标记等。;分子标记是指以生物大分子的多态性为基础 的遗传标记 。 广义的分子标记包括同工酶标记和DNA标记 狭义的分子标记仅指DNA标记 DNA标记主要有： ;RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片断长度多态性) 它是由于核酸序列不同而造成的DNA限制性 片断之间产生等位基因差异的结果。 2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长度多态性)。4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长???多态性)。 ;RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)是1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展 起来的一种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段， 通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性 ; 一般讲,通过PCR扩增产生的不连续的几个DNA产物,往往是由于不同的遗传位点而产生,多态性的产生是由于突变或重排而造成的,这些变化可以发生在引物结合位点上,也可以位于引物结合序列之间。 ;RAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴定的工作原理 ;它们的基因组DNA 限制性内切酶位点的种类和数目不同，用各自DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的 DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异 ;RAPD技术操作过程：;三、试剂 　　1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。 　　2、Taq酶：购买成品。 　　3、10xPCR 缓冲液。 　　4、MgCl2 ：25mmol/L。 　　5、dNTP：每种2.5mmol/L;四、操作步骤： 　　1. 在25ul反应体系中,加入 模板DNA 1ul (50ng) 　　随机引物 1ul (约5pmol) 　　10xPCR Buffer 2.5ul 　　MgCl2 2ul 　　dNTP 2ul 　　Taq酶 1单位（U） 　　加ddH2O 至 25ul 　　混匀稍离心, 加一滴矿物油。 ; 2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共35轮循环。 　　3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V（电压低带型整齐， 分辨率高）。 　　5. 电泳结束，观察、拍照。 ;PCR(聚合酶链式反应)，即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。PCR循环过程有三种不同的事件发生： 1. 模板变性（92-96℃）； 2. 引物退火（37-65℃）； 3. 热稳定DNA聚合酶进行DNA合成---延伸（72℃）。 ;;;变性、退火、延伸的循环过程---PCR扩增。在第二个循环中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的DNA扩增一倍，25-35个循环后，目的DNA将达到106倍。琼脂糖电泳、EB染色即可得到DNA指纹图谱。;注意事项 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。 　　2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。 ;RAPD技术的优点 ;④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交； ⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性； ⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。; 但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能是RAPD技术重复性差的直接原因。;目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性： ①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准化； ②提高扩增片段的分辨