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垂直电泳分离同工酶（活性染色鉴定法） 实验目的： 理解同工酶的概念及遗传学意义 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色 乳酸脱氢酶 用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组 织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚 体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同 同工酶的 免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。 LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形 成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交 而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。 实验器材： 夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳 压电源（电压300-600V，电流50- 100mA），移液枪（各种量程），烧杯 （100mL），培养皿, 实验流程 试剂的配制 仪器的准备 动物组织的样品的获取 分离胶（30分钟） 浓缩胶（30分钟） 电泳（2-3小时） 染色（30分钟） 观察结果 样品制备 取材：　大黄鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.鳃、4.肌肉、5.脾、6.鳍、7.肝、8.心脏　放入冰箱保存。 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需４℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为１：5,用研钵研磨充分。浆液４℃离心约３０分钟，１５０００转／分钟。 取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加１００ul 甘油 和１０ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。 分离胶的制备 将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用。取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使用。 浓缩胶的制备 TEMED最后一个加入，轻轻混匀。移液枪吸取加入约2.0CM左右高度的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成。再放置30－60min后可以使用。 加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓冲液备用。 电 泳 电压和电流：浓缩胶电压100v，分离胶电压180V. 电流流18－30mA 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约2-3个小时 乳酸脱氢酶染色剂的配制 乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M Tris－Hcl溶液（PH8.0）10ml 去离子水定容至50ml 染色与观察 将胶从中间切成2块，各自切去一个小角（作为标记），去离子水轻轻从玻璃板上吹下， 置于大培养皿中，去离子水浸洗之后倒入染 染色剂浸没，避光于37度摇床中染色30min。 观察拍照 思考题： 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？哪些过程中是 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？ 谢谢 * * 同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。 它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同. 由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。 本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定 一、试剂： 1.凝胶储备液： Ａ储备液： pH8.9 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加双蒸水到 80ml，调节pH到8.9定容到100ml。 Ｂ储备液 ： pH6.7 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 Ｃ储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。 Ｄ储备液： 浓缩胶储备液：10g Acr，2.5g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4℃可以保存1个月。 Ｅ储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。 Ｆ储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED 2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用时稀释10倍。 20 10ul 13.75 0.1 3.75 2.