抗菌肽c点aerin1.1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究.docx

华中农业大学2016届硕士研究生学位论文3．2．4 华中农业大学2016届硕士研究生学位论文 3．2．4 Caerinl．1时效观察 ．．16 3．2．5 Caerinl．1抗病毒活性的剂量依赖 ．．17 3．2．6 Caerinl．1作用条件 ．．17 3．2．7 Caerinl．1对PEDV的抑制效果 ．．18 3．2．8 Caerinl．1抗病毒作用机制 ．．18 3．2．9 Caerinl．1对PEDV的直接杀伤效果 ．．20 3．2．10 Caerinl．1对病毒吸附入侵阶段的影响 20 3．2．11 Caerinl．1对病毒组装释放阶段的影响 21 3．2．12 Caerinl．1的细胞内定位 22 第4章结果与分析 ．．23 4．1抗菌肽对PEDV的抑制效果 23 4．1．1各抗菌肽对PEDV-YN株的抑制效果 23 4．1．2细胞毒性分析 23 4．1．3联合作用抗病毒效果 24 4．1．4温度对Caerinl．1时效的影响 ．25 4．1．5 Caerinl．1抗病毒活性的剂量依赖 ．．26 4．1．6 Caerinl．1与PEDV的最适孵育条件 ．．27 4．1．7 Caerinl．1对PEDV其它毒株的抑制效果 ．．28 4．2 Caerinl．1对PEDV的抑制机制 ．29 4．2．1不同时间点的抑制效果 29 4．2．2对PEDV的直接杀伤效果验证 ．．30 4．2．3对PEDV吸附入侵阶段的影响 ．．31 4．2．4对PEDV增殖释放阶段的影响 ．．33 4．2．5在Vero细胞内的定位 ．34 第5章讨论与结论 ．．35 5．1讨论 ．35 5．1．1不同抗菌肽对PEDV抑制效果差异分析 ．．35 5．1．2 Caerinl．1抑制PEDV的机制 ．．36 5．1．3抗菌肽的优缺点及应用前景 37 万方数据 抗菌肽Caerinl．1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究5．2．结论 抗菌肽Caerinl．1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究 5．2．结论 38 参考文献 39 附 录 ．49 致谢 ．51 III 万方数据 抗菌肽CaerinI．1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究摘 抗菌肽CaerinI．1抑制猪流行性腹泻病毒增殖的研究 摘 要 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)感染可造成各年龄段 猪群发生腹泻、消瘦，感染仔猪死亡率可达80％～100％，急需有效药物用于特异性 防控，但目前该病以免疫预防为主，没有合适且高效的药物。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是动植物在天然免疫中产生的小分子多肽，有广谱抗微生物活性。已 有文献报道抗菌肽对囊膜病毒的感染、增殖有较好的抑制作用，但未见其具体对猪 流行性腹泻病毒的作用研究。本研究探索了本实验室合成的五种抗菌肽对PEDV的 体外抑制效果，筛选出抗病毒活性较高的抗菌肽Caerinl．1，研究了其抗病毒活性和 机制，主要结果如下： 1．确定不同抗菌肽的抗病毒活性和细胞毒性 分别用5种抗菌肽(Caerinl．1，Picidinl，Maculatinl．1，Lactoferricin B，Indolicidin 等)与PEDV孵育，测定TCID50。结果显示Caerinl．1与Picidinl抑制效果显著， 且Caerinl．1优于Picidinl。在抗菌肽浓度低于110I．tg／mL的条件下，二者细胞毒性 都很小，细胞相对活力均可达到80％以上，显微镜下观察细胞形态良好，因此后续 研究中所用的抗菌肽浓度均处于安全范围内。 2．Caerinl．1孵育条件及gp韦lJ效果探索 分别设置孵育温度和孵育时间梯度，孵育后倍比稀释并接种Vcro细胞，测定病 毒TCID50，结果发现，最佳孵育条件为37℃孵育lh。Caerinl．1和Picidinl对PEDV 的抑制效果显著，但两者没有协同作用。Caerinl．1对3个不同PEDV毒株的抑制效 果均十分显著且呈剂量依赖，PEDV-YN株病毒滴度可从1045下降至10一一。 3．抗菌肽Caerinl．1直接杀伤病毒。发挥其抗病毒作用 设置抗菌肽与病毒作用的3个不同方式，即Caerinl．1与细胞提前孵育lh后接 种PEDV；Caerinl．1与PEDV孵育lh后接种于细胞；细胞先接种PEDV lh后加入 Caerinl．1。测定TCID50，绘制生长曲线，结果表明Caerinl．1与病毒提前孵育时病 毒滴度下降最多，其他两种处理方式时，PEDV滴度仅有一定程度下降，说明 Caerinl．1发挥作用的主要阶段在与病毒直接孵育的过程。 通过透射电子显微镜观察发现，抗菌肽和病毒孵育后破坏病毒囊膜完整性， Western blot试验发现，抗菌肽和病毒直接孵