慢病毒介导的shRNA干扰PTEN表达促皮层神经元轴突再生及脊髓损伤.PDF

·428· 中华骨科杂志2015年4月第35卷第4期 ChinJOrthop,April2015,Vol.35,No.4 ·基础与骨病· 慢病毒介导的shRNA干扰PTEN表达促皮层 神经元轴突再生及脊髓损伤修复 卢璐 周恒星 禇天慈 李付元 刘俊 史仲举 孔晓红 冯世庆 【摘要】 目的 观察慢病毒介导特异性短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）干扰第l0号染色体同源丢失性磷酸 酶张力蛋白基因（phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen，PTEN）表达对皮层神经元轴突再生及脊髓损 伤修复的影响。方法 体内实验和体外实验两部分各分四组：阴性对照组（DMEM）、空载慢病毒组（Lenticontrol）、空白载 体组（Lentiscramble）、慢病毒介导shRNA组（LentishRNA）。体外神经元转染72h后，Westernblot检测各组PTEN表达情 况，免疫荧光检测神经元轴突再生能力；体内载体注射1周后，Westernblot检测各组PTEN表达情况；6周后荧光显微镜观 察皮质脊髓束穿越脊髓损伤局部周围增强绿色荧光蛋白荧光强度及突触素表达情况。采用大鼠脊髓损伤评分评价大鼠 后肢运动恢复情况。结果 慢病毒介导shRNA组体外转染神经元后PTEN表达水平比阴性对照组下降83.75%±2.85%，与 其他组比较具有统计学意义（F=4277，P0.05）；轴突长度（249.70±10.70）μm，大于阴性对照组（95.71±20.24）μm、空载慢 病毒组（97.00±22.82）μm及空白载体组（87.57±19.34）μm，差异具有统计学意义（F=84.74，P0.05）；每个神经元一级突起 数量（5.800±0.359）个，大于阴性对照组（2.800±0.678）个、空载慢病毒组（2.900±0.389）个及空白载体组（3.000±0.877）个， 其差异具有统计学意义（F=16.47，P0.05）；神经元突起穿越硫酸软骨素蛋白多糖基质的百分比20.60%±1.80%，大于阴性 对照组6.70%±1.45%、空载慢病毒组5.50%±1.69%、空白载体组5.60%±1.77%，其差异具有统计学意义（F=94.90，P 0.05）。慢病毒介导shRNA注射大脑皮层运动区后，第6周大鼠脊髓损伤评分达（13.29±0.42）分，高于阴性对照组（7.00± 1.48）分，空载慢病毒组（6.43±1.43）分，空白载体组（6.29±1.22）分，其差异具有统计学意义（F=44.85，P0.05）。皮层组织 PTEN表达水平下降84.57%±1.87%，损伤中心尾端见绿色荧光，突触素染色阳性面积明显增大。结论 慢病毒介导shR⁃ NA下调PTEN基因表达后可明显提高脊髓损伤后轴突再生能力，促进神经功能修复。 【关键词】 脊髓损伤；RNA干扰；慢病毒属；轴突；再生 TargetingPTENwithlentiviralshRNApromotesneuriteoutgrowthofcorticalneuronsandimprovesfunctionalrecov⁃ eryinaratspinalcordcontusionmodel LuLu*,ZhouHengxing,ChuTianci,LiFuyuan,LiuJun,ShiZhongju,KongXiao⁃ hong,FengShiqing.*DepartmentofOrthopaedics,TianjinMedicalUniversityGeneralHospital,Tianjin300052,China 【Abstract】 Objective ToobservetheeffectsofPTENsilencingonaxonregenerationandfunctionalrecoveryafterspinal cordinjury(SCI). Methods Fourgroupsweredesigned:DMEM、lenti⁃control、lenti⁃scramble、lenti⁃shRNA.Corticalneurons wereseededonoradjacenttochondroitinsu