第4章-载体的选择与构建.ppt

* (l)SV40病毒的生命周期　　根据SV40病毒感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。我们称这种感染效应为裂解感染(lytic infection)，而猿猴细胞则叫做受纳细胞(permissive cell)。但如果感染的是啮齿动物(通常是仓鼠和小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，也就是说发生了癌变。我们称这种啮齿动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞(non-permissive cell) 。人体细胞是SV40的半受纳细胞(semi-permissive cell)，因为同SV40病毒接触的人体细胞中，只有1%～2%会产生出感染性的病毒。　　SV40病毒对猿猴细胞的裂解感染可分成三个不同的时相。在感染了寄主细胞之后，有一段长达8～12小时的潜伏期，在这个期间，病毒颗粒脱去蛋白质外壳，同时DNA逐渐地转移到寄主细胞核内；紧接着4小时为早期时相，此时发生早期mRNA和早期蛋白质的合成，并出现病毒诱导寄主细胞DNA合成的激发作用；在这以后的36小时称为晚期时相。进行病毒DNA、晚期mRNA和晚期蛋白质的合成，并在高潮时发生病毒颗粒组装。大约在感染的第三天，细胞裂解，平均每个细胞可释放出10E5个的病毒颗粒。　　(2)SV40病毒的基础分子生物学　　SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。同其它病毒不同，SV40 DNA是同除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相结合。这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。感染之后的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区(图8-14)。围绕在SV40 DNA复制起点周围约 400bp的 DNA区段，是十分引人注意的。例如，现在已经弄清紧挨这个起点的DNA序列，是调节早期和晚期初级转录本合成的控制信号。早期转录本的合成，就是由位于这个区段内的由一对72核苷酸序列串联而成的强化因子序列激活的。SV40病毒基因组表达的一个重要特点是，它的RNA剪辑模式非常复杂。通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA)；而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。　　这2种早期mRNA分别编码大T抗原的小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。晚期转录本按照其特定的沉降系数，可区分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vp1、Vp3和Vp2病毒蛋白质。Vp1编码区同Vp2和Vp3的编码区是以不同的转译结构形式彼此交叠的(表8-3)。　　(3)SV40病毒的增强子序列　　在SV40病毒基因组中存在着一个增强子序列。其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组DNA复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。　　外源的基因可以融合在SV40 DNA的早期转录区段内，而SV40的增强子又能够有效地激活SV40早期转录单位的转录活性。因此显而易见，SV40增强子在哺乳动物的基因操作中是相当有用的。此外，SV40增强子还可以增强由细胞启动子启动的基因转录作用。　 加辅助病毒后高温培养，只有共转染的细胞内有T抗原和包装蛋白，形成空斑。空斑中有两种病毒，一种为辅助病毒，另一种为重组病毒，需要再次感染分离重组病毒 仅仅被辅助载体感染的细胞无T抗原，避免干扰筛选。 * * 另有一类整合型pSV2载体，不含T抗原，所以无法激活复制，只能整合在染色体上，因此非常的稳定，可以建立稳定的细胞系。 * Retroviral reverse transcription[edit] Retroviruses, also referred to as class VI?ssRNA-RTviruses, are RNA reverse transcribing viruses with a DNA intermediate. Their genomes consist of two molecules ofpositive sense?single stranded RNA with a?5 cap?and?3 polyadenylated tail. Examples of retroviruses include the human immun