细菌转化是水平基因转移的重要途径之一.PPT

固体平板转化法检测细菌 质粒DNA的水平转移现象 实验目的 1、了解细菌水平基因转移的主要途径、基本原理； 2、学习大肠杆菌固体平板转化实验的基本方法。 许多细菌可以建立自然感受态，能从环境中摄取DNA改变自身遗传结构，获得新的表型。细菌转化是水平基因转移的重要途径之一。 Dubnau, Annu Rev Microbiol, 1999 53:217-44 大肠杆菌氯化钙平板转化方法 1、菌种活化：挑取大肠杆菌单菌落接种于 5 mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜； 2、菌液准备 （1）按1/100转接量，转接于50 mL新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600 = 0.5~0.55（3 h 左右）。 （2）按3 mL分装到无菌试管中，置冰浴。 3、转化选择平板准备 先摇匀融化好的150 mL的LB，在 50~60℃时，加入150 ?L 100 mg/mL的氨苄青霉素（终浓度100 ?g/mL），混匀，倒 9块平板（每组4块）； 置45℃预热； 4、感受态制备及转化（按4人小组进行） （1）用移液器取1 mL菌液于1.5 mL 微量离心管中，每小组取2支；冰浴冷却5~10 min； ★ 冰浴很重要！已冰浴的菌液可适当缩短冷却时间。 （2）12 000 r/min离心30 s，弃上清，用移液器吸去残液，保留菌体沉淀； （3）每支微量离心管中各加入50 ?L 新鲜LB培养基，重悬细胞； 4、感受态制备及转化（按4人小组进行） （4）合并两支管中的菌悬液，取80 ?L菌悬液加入装有1 ?L pDsRED质粒（620 ng/ ?L ）微量离心管(500 ?L )中，混匀，冰浴5~10 min ；等体积加入室温氯化钙溶液；冰浴5~10 min ； （5）分别取20、40、80 ?L转化混合物涂布于45℃预热的选择平板； （6）步骤（4）剩余的20 ?L菌悬液直接涂布于选择平板，作为阴性对照； （7）37℃倒置培养20 h后计算转化频率。 冰浴 12 000 r/min离心30 s 50 ?L LB*2重悬细胞 注意平衡！ 吸弃上清 保留沉淀 合并菌悬液 80 ?L加入到质粒管 20 ?L细胞悬液 冰浴5 ~ 10 min 加入等体积氯化钙溶液 冰浴5 ~ 10 min 涂布预热的氨苄选择平板 分别取20、40、80 ?L 20 ?L 结果与分析 根据平板上转化子数与平板内转化混合物涂布量计算转化频率或效率（菌浓度按2×1010 CFU/mL计 ）； 转化频率 = 转化子数 / 活菌总数 转化效率 = 转化子数 / ?g转化DNA 思考题 将“剩余的20 ?L菌悬液直接涂布于选择平板”作为对照的目的是什么？