益母草碱--半胱氨酸类似物的缀合物都的合成及其心肌保护作义用机制的初步研究.docx

复旦大学博士学位论文中文摘要 复旦大学博士学位论文 中文摘要 【目的】中药益母草中的有效成分益母草碱和半胱氨酸类似物均已被证实具 有心脏保护作用。鉴于两者良好的药理活性，本研究以二者为先导化合物，设计 并合成了一系列益母草碱一半胱氨酸类似物的缀合物，比较益母草碱与不同的半 胱氨酸类似物的缀合物对心肌细胞损伤的保护作用，筛选优势候选化合物，并探 讨其对缺血性损伤心肌细胞的抗氧化和抗凋亡作用，进一步阐明其作用机制，为 临床有效治疗缺血性心脏病研发新药提供理论基础。 【方法】第1部分：以丁香酸为起始原料，依次经过羰基化反应，酯化反应 和酯的水解等反应，合成得到益母草碱与半光氨酸类似物相结合的缀合物，并采 用MS、NMR和HRMS对其结构进行鉴定，采用HPLC对新化合物的纯度进行 分析。第2部分：以原代乳鼠心肌细胞为研究对象，分为常氧处理组、缺氧模型 组、益母草碱．半胱氨酸类似物的缀合物处理组。MTT法检测细胞存活率，比色 法检测培养液中乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)活性、细胞上清液H2S 浓度及运用Hoechst染色观察细胞形态。第3部分：以原代乳鼠心肌细胞为研究 对象，分为常氧处理组、缺氧模型组、新化合物1a处理组。比色法检测超氧化 物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、活性氧 物质(ROS)、脂质过氧化产物(MDA)和凋亡相关因子Caspase．3活性；采用 RT．PCR方法观察bcl．2、bax、caspase．3及胱硫醚-丫．裂解酶(cystathione吖．1yase， CSE)mRNA的表达；采用Western Blot方法观察Bcl．2、Bax、Caspase．3、CSE、 Akt的表达；Annexin V．FITC／PI双染观察凋亡变化；采用JC．1染色法观察线粒 体膜电位的变化；采用透射电镜的方法观察心肌细胞超微结构的变化。 【结果】第1部分：设计并合成一系列益母草碱．半胱氨酸衍生物的缀合物， 并经MS、NMR和HRMS对其结构进行确认，HPLC纯度分析结果表明新化合 物的纯度符合实验要求。第2部分：新化合物la、1b和2具有心肌细胞的保护 作用，其中1a的药理活性优于lb和2；新化合物1a与其前体化合物益母草碱 和SPRC比较，其用药浓度为益母草碱的1／10和SPRC的1／100，表明新化合物 1a的效价优于其前体化合物。新化合物1a能提高缺氧心肌细胞的存活率、降低 心肌细胞LDH的漏出率，上调H2S的含量。第3部分：新化合物1a能提高心 肌细胞内SOD、CAT酶的活性，降低ROS和MDA的含量；上调bcl一2基因和 蛋白的表达，下调bax和caspase．3基因和蛋白的表达，改善线粒体膜电位的降 低，保护缺氧心肌细胞器的完整性；上调CSE基因和蛋白的表达，增加Akt的 磷酸化水平。 【结论】新化合物1a具有心肌保护作用，其涉及的主要机制包括：提高抗 2 复旦大学博士学位论文氧化酶活性，降低细胞氧化应激水平；调节凋亡相关蛋白，主要是通过阻止 复旦大学博士学位论文 氧化酶活性，降低细胞氧化应激水平；调节凋亡相关蛋白，主要是通过阻止 Caspase．3的凋亡途径发挥作用；调节CSE／H2S信号途径，增加缺氧心肌细胞H2S 水平；增加细胞生存通路中Akt的磷酸化水平，减少细胞死亡。 【关键词】益母草碱；半胱氨酸衍生物；益母草碱．半胱氨酸衍生物的缀合 物；合成；缺氧；氧化应激；急性心肌梗死；硫化氢；凋亡 【中图分类号】R96 3 复旦大学博士学位论文————————————————————————————————————————————一一一一 复旦大学博士学位论文 ————————————————————————————————————————————一一一一 ABSTRACT Objectives：Both of leonurine，a plant alkaloid present in Chinese mother、vort． and cysteine analogues had been reported to have cardioprotective effects．In view of these，we designed，synthesized and biologically evaluated a serial of leonurine。cysteine analogues conj ugates．We considered to compare all of these novel compound and to select the best one as a candidate of cardiop