微生物生理学（王海洪）6细菌结构基因的鉴定副本.pptVIP

细菌基因文库构建 要求 制备100kb以上的基因组DNA。 选择合适的限制性内切酶，部分切割总DNA，回收25-40kb的DNA片段。 细菌基因文库一般选用cosmid克隆载体。 柯斯载体（cosmid）：一类人工构建的含有λ噬菌体DNA 的cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。 复制子一般为ColE1的，携带抗性基因，如AmpR。有λ噬菌体的cos序列。有多克隆位点（MCS），大小一般为7－10kb，能在大肠杆菌中转化和增殖。能携带大小为30－45kb的外源DNA片段。 体外连接时，外源DNA片段与柯斯载体连接成线性DNA，λ噬菌体头部包装蛋白识别线性DNA上的两个cos位点，进行包装，产生有感染能力的重组噬菌体颗粒，用于感染宿主细胞。 柯斯载体克隆的策略 体外包装 λ噬菌体在大肠杆菌体内以滚环形式复制，形成多联体线状DNA，其外壳蛋白能识别cos位点，并将两个cos位点间的DNA包装，形成成熟的λ噬菌体。 研究发现缺失D包装蛋白的λ噬菌体突变株和缺失E 包装蛋白的λ噬菌体突变株，均不能单独包装λ 噬菌体DNA，但将两种突变株分别感染大肠杆菌，从中提取缺失蛋白D的包装物(含E蛋白) 和缺失E蛋白的包装物(含D蛋白)，两者混合后就能包装λ噬菌体DNA。 目前D包装蛋白和E 包装蛋白已经商品化，可直接用于包装重组DNA，感染宿主大肠杆菌，构建柯斯文库。 注意 完整的基因文库，必须使任何一个基因进入库内的概率均达99 ％。换句话说，要求在文库内钓取任何一个基因，均有99 ％的可能性。因此需要估算文库至少包含多少个阳性克隆。 用于计算基因文库应有的克隆数（N值），公式如下： N＝ln(1－P)/ln(1－f/g) 其中，P为从基因文库中选出的任一基因概率，一般定为99％（0.99）；f为载体容量（kb）；g为基因组大小（kb）。 细菌未知基因的鉴定：遗传互补 以鉴定霍乱弧菌烯脂酰ACP还原酶基因（fabV）为例： 使用福斯载体（fosmid）和专一性宿主（大肠杆菌EPI300）构建基因文库。 福斯载体（fosmid）：pCC1FOS 具有一般质粒、F因子和λ噬菌体的三重特性。 携带有F因子单拷贝复制子，可调控的高拷贝复制子和λ噬菌体的cos位点。 像一般柯斯载体一样可进行体外重组和包装，感染大肠杆菌宿主菌后可像F因子一样以单拷贝存在，在诱导条件下可增加拷贝。 宿主菌：EPI300 专一性地与pCC1FOS匹配，诱导时能提供高拷贝复制子复制所需的TrfA蛋白。 EPI300的改造 EPI300为烯脂酰ACP还原酶原养型菌株，不宜直接用于筛选霍乱弧菌烯脂酰ACP还原酶基因。 大肠杆菌JP1111为烯脂酰ACP还原酶基因（fabI）温度敏感突变菌株，但是不宜直接做为福斯载体的宿主用于基因文库构建。 大肠杆菌fabI位于染色体29分钟处，trpC基因位于28.38分钟处。 有一菌株CAG18455为trpC::Tn10，四环素抗性。 以EPI300 fabI(Ts) trpC::Tn10为宿主构建霍乱弧菌的基因组文库，并在42°C筛选可生长的菌株，在经多次亚克隆，得到fabV。 细菌未知基因的鉴定：酶活性鉴定 遗传互补不仅可以互补大肠杆菌突变菌株，也可以互补其它细菌的相应突变菌株。但是在互补其它细菌时使用的柯斯载体上应该携带能够通过接合转移的基因序列，如pLAFR3。 Massengo-Tiasse, R. P., and J. E. Cronan. 2008. Vibrio cholerae FabV defines a new class of enoyl-acyl carrier protein reductase. J. Biol. Chem. 哈氏弧菌（Vibrio harveyi）中有一种脂酰ACP合成酶，催化脂肪酸直接合成脂酰ACP。编码基因未知。 用EPI300和福斯载体构建哈氏弧菌的基因组文库，将文库菌制备无细胞提取物，并检测Aas活性克隆基因。最终获得克隆。 Jiang, Y., C. H. Chan, and J. E. Cronan. 2006. The soluble acyl-acyl carrier protein synthetase of Vibrio harveyi B392 is a member of the medium chain acyl-CoA synthetase family. Biochemistry. 细菌未知基因的鉴定：Southern杂交 通过一定的技术能获得部分未知基因的序列，如生物信息学能提供该基因的保守序列或者能获得部分蛋白质氨基酸序列等。 根据部分基因序列制备标记杂交探针，通过原位杂交获得阳性克隆，确定未知基因。 也可以直接用探针与经过适当酶切的总DNA杂交，得到目的片