非接触式共培养下miRNA-100由间充质干细胞向肝癌细胞传递.doc

非接触式共培养下miRNA-100由间充质干细胞向肝癌细胞传递 研 究 生：某某某 申 请 人：某某某（在职人员） 指导教师：某某某 摘 要 目的 本研究分析在非接触式共培养条件下，MSCs通过分泌MV向肝癌HepG2细胞传递microRNA-100的可能性及其途径，为基于MSCs的肝癌基因治疗提供新的实验依据。 方法 常规进行MSCs复苏和培养，挑选生长状态较好的MSCs接种于24孔板内，采用阳离子脂质体Oligofectamine将人工化学合成5端具有Cy3荧光标记miRNA-100介导转染MSCs。实验共设三组，miRNA-100实验组，空白对照组和单纯脂质体对照组，每组设三个复孔。将转染后的细胞放入二氧化碳培养箱内继续培养至检测时间点。 MSCs转染24小时后，采用ExoQuickTM分离提取试剂盒获得MSCs分泌的MV，提取总RNA，反转录合成cDNA，采用实时定量PCR技术检测二者中miRNA-100的表达水平，以U6作为内参对照。 3. 将转染后的MSCs培养24小时，分离提取其培养基中的MV，利用激光共聚焦显微镜观察分析miRNA-100的表达情况。 4. 把转染24小时后的MSCs与肝癌HepG2细胞在Transwell培养体系中进行非接触式共培养，MSCs接种在上室，HepG2细胞接种在下室。在此体系中，MSCs不能够穿过上室底部的聚碳酸酯膜进入下室，但其分泌的MV可以穿过聚碳酸酯膜进入下室。共培养36小时后，利用激光共聚焦显微镜观察和分析miRNA-100在HepG2细胞中的表达情况。 结果 1. 实时定量PCR检测发现在MSCs及其分泌的MV中均存在有miRNA-100。miRNA-100在MV中表达量有所增高，但与在MSCs中的表达量相比无明显差异 （P0.05）。 2. 免疫荧光化学分析发现在MSCs及其分泌的MV中均可见带有Cy3荧光标记的miRNA-100, 主要分布在细胞胞浆及核膜周围，转染率达80%以上。 3. 转染后的MSCs与HepG2细胞在Transwell体系中进行体外非接触式共培养36小时后，在激光共聚焦显微镜下观察，发现带有Cy3荧光标记的miRNA-100在HepG2细胞中有表达，主要分布在胞浆中及核膜周围。 结论 在细胞非接触条件下，miRNA-100可由MSCs向肝癌HepG2细胞进行传递，这可能是通过MSCs分泌携有miRNA-100的微泡体这一新的细胞通讯途径完成的。 关键词 间充质干细胞，microRNA-100，肝癌，共培养，微泡体