禽流感病毒H9N2血凝素基因及神经氨酸酶基因.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（７）：３３３８ 禽流感病毒Ｈ９Ｎ２血凝素基因和神经氨酸酶基因 在真核酵母菌中的表达 １ １ ２ ３ １ １ ２ １ 张　烨 　于在江 　唐启慧 　陈禹保 　辛　丽 　陈永坤 　陈清轩 　舒跃龙 （１中国疾病预防控制中心病毒病所国家流感中心　北京　１０００５２） （２北京标凯科技有限公司　北京　１０００９４　３北京中亚国瑞生物经济研究所　北京　１０２２０６） 摘要　目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒Ｈ９Ｎ２血凝素基因（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）和神经氨酸酶基 因（ｎｅｕｒａｍｉｄｉｎａｓｅ，ＮＡ）序列，为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病 毒Ｈ９Ｎ２全长ＨＡ、ＮＡ基因并测序的基础上，将部分基因序列克隆到表达载体ｐＭＥＴＡ上，构建了 重组表达质粒 ｐＭＥＴＡ／ＨＡ（５２～１５４５ｂｐ），ｐＭＥＴＡ／ＮＡ（１２１～１２５４ｂｐ），电转化真核酵母菌 ２＋ ｐＭＡＤ１６，甲醇诱导表达，利用 Ｎｉ 亲和层析柱对重组蛋白进行纯化，并用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和 ＥＬＩＳＡ方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在酵母菌中可以高效表达，ＳＤＳＰＡＧＥ显示蛋白表达 后形成了二聚体，蛋白纯度占总蛋白的９５％以上，ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ实验证实，重组蛋白具 有良好的抗原性。结论：成功克隆和表达了禽流感病毒 Ｈ９Ｎ２ＨＡ、ＮＡ基因序列，为禽流感病毒 Ｈ９Ｎ２诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。 关键词　禽流感病毒Ｈ９Ｎ２　血凝素　神经氨酸酶　真核酵母表达 中图分类号　Ｑ７８６ 型的 ［７８］ 　　禽流感（ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）又名欧洲鸡瘟、真性鸡 ＡＩＶ ；说明流感病毒（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ＩＶ）已突 瘟，是由正黏病毒科Ａ型流感病毒引起的一种禽类的 ［９］ 破了种间屏障 。目前的研究表明：Ｈ９Ｎ２亚型的ＡＩＶ ［１］ 感染或／和疾病综合症 。是现代化养禽业难以对付 是引起１９９７年香港 Ｈ５Ｎ１亚型ＡＩＶ的内部基因的供 的重要禽类呼吸道传染病之一。我国《中华人民共和国 ［２］ 体 。从已有的报道分析，禽流感病毒Ｈ９Ｎ２亚型已成 动物防疫法》和世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定该病为Ａ 为中国当前的主型。Ｈ９Ｎ２亚型禽流感病毒的流行范 ［２］ 类烈性传染病 。自１８７８年在意大利鸡群首次爆发 围遍及全球且目前尚无有效地预防措施，因此，Ｈ９Ｎ２ 以来，世界各地都相继有各种亚型的禽流感病毒引起 亚型禽流感病毒基因工程疫苗和快速诊断试剂的研制 ［３］ ＡＩ的流行。Ｈ９亚型禽流感最早报道于１９６６年 ，２０ 有着广阔的前景。近年来，随着血清学实验技术的发 世纪 ９０年代开始，Ｈ９亚型禽流感病毒 （ａｖｉａｎ ［４］ 展，有几项技术常用于禽流感的监测和诊断，如用血 ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）已在亚洲鸡群广泛流行 。我国 凝抑制（ＨＩ）试验检测抗血凝素（ＨＡ）的抗体，用琼脂 自１９９４年