TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成.ppt

TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL) ??TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。 TUNEL 主要试剂 1. 缓冲液(Labeling Buffer)： 用于维持一定的反应条件，含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 (氯化钴)、1mmol/L DTT(二硫苏糖醇)。 2.末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT) ： 催化3’-OH末端 dUTP反应的关键酶 3.荧光素-dUTP ： TdT的底物和本实验的标记物 4.蛋白酶K： 消化组织，增加细胞通透性 凋亡细胞的特征是:内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的 3’-OH末端 。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA的3’-末端。 TUNEL的原理是：用荧光素（fluorescein）标记的脱氧核糖核苷酸，在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，用荧光显微镜即可观察结果。在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体，可进一步放大检测信号，并且普通显微镜观察实验结果。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。 TUNEL原理 实验流程 结果 注意事项 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂或DNA裂解不完全，此时不适用TUNEL法检测，进而产生假阴性结果。 在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断， 从而引起假阳性结果。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标 * * TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项 TUNEL的原理 标本处理 实验步骤 *