泛耐药鲍曼不动杆菌临床株w61耐药与播散机制的基因组学研究临床医学内科学传染病学专业论文.docxVIP

天津医科大学博士学位论文中文摘要 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)是医院内感染中常见的一种病 原菌，其耐药问题日趋严重，中国CHINET细菌耐药性监测报告，2010年鲍曼 不动杆菌泛耐药株分离率高达21．4％，较2009年17．0％又有所增加，且均高于 同年铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌科细菌的泛耐药株分离率。多重耐 药和泛耐药的鲍曼不动杆菌，已成为临床亟待解决的棘手难题。近年来，随着 高通量测序技术的快速发展，基因组学和比较基因组学的研究方法为细菌学领 域引入新的研究平台。本实验采用微生物学、分子生物学和生物信息学分析方 法揭示泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61的多重耐药和耐药播散的机制，为指导 临床合理使用抗菌药物，避免或减少细菌耐药性的出现，防控细菌耐药播散， 研发新型抗菌药物和新作用靶位提供依据。 研究目的 1、 了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61的基因组基本特征，分析其多重耐药 表型与耐药基因型。 2、 了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中外排泵系统的分布，分析外 排泵(AdeABC、AdeIJK、AdeFGH、AbeM、AbeS、CraA、MdtL、AmvA及 ABTJ 00034／35／36、ABTJ 00275／276／277等5个功能未知的外排泵)和外膜蛋 白(OmpA、OmpW)的表达，探索外排泵和外膜蛋白在菌株多重耐药中的作用。 3、 了解泛耐药鲍曼不动杆菌临床株W61基因组中可移动元件(整合子、转座 子、插入序列、质粒)的分布，探讨耐药播散机制。 研究方法 1、 菌株收集与药敏试验：收集自2009年天津市某三级甲等医院临床分离的鲍 曼不动杆菌W61，经常规、生化、APl20NE纸条鉴定。采用微量肉汤稀释法和 琼脂纸片扩散法测定鲍曼不动杆菌W61对16种常用抗菌药物(哌拉西林他唑巴 坦、头孢氨噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、头孢吡肟、头孢哌酮／舒巴 坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、莫西沙星、亚 胺培南、美罗培南、多粘菌素)的MIC值(或抑菌圈直径)，确定其耐药表型。 2、全基因组高通量测序与序列分析：应用Roche 454 FLX测序平台，对鲍曼不 动杆菌临床株W61进行全基因组测序，利用相关软件和聚合酶链式反应(PCR) 天津医科大学博士学位论文填补空缺片段，拼接完整的基因组序列，提交Genbank。应用BASys细菌注释 天津医科大学博士学位论文 填补空缺片段，拼接完整的基因组序列，提交Genbank。应用BASys细菌注释 系统进行基因组和质粒的基因注释，分析菌株耐药表型与耐药基因型的关系。 3、 泵抑制剂干预试验与外排泵及外膜蛋白基因表达检测：采用微量肉汤稀释 法测定未加用和加用泵抑制剂CCCP时鲍曼不动杆菌临床株W61对8种抗菌药 物(左氧氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、氯霉素、庆大霉素、阿米卡星、头孢 他定、头孢哌酮／舒巴坦)的MIC值，了解泵抑制剂对菌株耐药表型的影响。应 用TransDB数据库分析多重耐药株W61基因组中外排泵系统的分布情况。选取 鲍曼不动杆菌ATCCl7978为对照株，以recA为内参基因，采用实时荧光定量 RT—PCR方法对鲍曼不动杆菌W61和ATCCl7978的13种外排泵基因(adeB、 adeJ、adeG、abeM，abeS、craA，mdtL，amvA及ABTJ一00035、ABTJ一00276 等5个功能未知的泵基因)和2种外膜蛋白基因(ompA、ompW)mRNA的表 达进行相对定量分析。泛耐药株W61外排泵AdeABC的调控系统AdeRS、外排 泵ABTJ 00034／35／36上游调控序列ABTJ 00033和外排泵AdeFGH的调控系统 AdeL的结构基因，与GenBank公布的ATCCl7978相应序列进行比对分析。 4、可移动元件分布：应用Genbank．nr和IS finder数据库，经序列比对分析鲍曼 不动杆菌临床株W61基因组中可移动元件(整合子、转座子、插入序列、质粒) 的分布及其携带的耐药基因，分析可移动元件在菌株耐药性的水平播散中的作 用。 研究结果 1、 药敏试验结果：鲍曼不动杆菌临床株W61对抗假单胞菌头孢菌素、碳青霉 烯类抗菌药物、含舒巴坦的复合制剂、氟喹诺酮类抗菌药物和氨基糖苷类抗菌 药物均耐药，对多粘菌素敏感，为泛耐药株。 2、基因组序列分析：泛耐药株W61基因组(Genbank登录号CP003500)全长 3964912bp，平均GC含量为39．11％，包含3731个蛋白质编码基因，6个rRNA 编码基因，74个tRNA编码基因；泛耐药株W61携带2个质粒，plasmidA全长 77528bp，