人工设计蛋白质及其定向进化突变体的实验分析生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 中国科学技术大学学位论文原创性声明 中国科学技术大学学位论文原创性声明 本人声明所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。除己特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何他人已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中作 了明确的说明。 作者签名：五豪 签字日期：型垒：堑：2 中国科学技术大学学位论文授权使用声明 作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者授权中国科学技术大学 拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权按有关规定向国家有关部门或机构 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文编入《中 国学位论文全文数据库》等有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。本人提交的电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 么开 口保密( 年) 作者签名： 至毵 导师签名： 签字日期：矽，∥‘．} 签字日期：九形∥．沙 万方数据 万方数据 摘要摘要 摘要 摘要 蛋白质从头设计最基本的目标是让设计的氨基酸序列折叠成预期的三维结 构。这一思路能够让我们更好地理解一级结构即氨基酸序列是怎么决定蛋白质 三级结构从而决定其功能的。现阶段尽管蛋白质设计已有多个实验验证成功的 例子，但其应用仍然受到诸多的限制。其瓶颈是其成功率不理想，追根溯源是 对于蛋白质折叠的理解不够深入，设计方法不够成熟。其中，完全基于结构分 析对于设计结果进行实验验证的方法成本高、周期长，导致对理论方法的验证 缺乏系统性，可靠的反馈信息较少等等，限制了设计方法的改进。为克服这一 困难，本文应用了一种把目的蛋白质结构稳定性与抗生素抗性偶联在一起的高 效实验体系，实现了对设计蛋白折叠性能的高效检验。本文进一步应用该体系 对初始折叠特性不佳的设计序列进行定向进化，发现这些设计结果实际上只包 含小的设计序列错误，可通过定向进化导入的点突变得以纠正。本文使用溶液 核磁共振或x．射线晶体衍射技术解析了三个人工蛋白质的三维结构，其一为直 接设计的结果，另两个为经定向进化后的突变体。这三个实测结构均和相应设 计模板高度一致。人工设计蛋白质和相应天然模板蛋白的高分辨率晶体结构比 较揭示了若干对决定三维结构可能具有关键作用的序列位点，本文进一步通过 定位点突变对这些位点的结构效应进行了分析。同时，还使用圆二色谱、差热 扫描量热分析研究了人工蛋白质的高温变性过程。这些设计蛋白质在表现出高 热稳定性的同时，其去折叠过程缺乏协同性。在这一点上，我们获得的人工设 计蛋白与大多数天然蛋白质不同， 然而与文献报道的大部分人工设计蛋白类 似。尽管其原因有待进一步研究，但至少证明折叠协同性并非形成正确、稳定 的三维结构所必须的。 在此基础上，我们选择了多个高度规则的空间结构分别作为理论设计的模 板，以对理论设计成功率进行较全面的鉴定。核磁共振谱图表明，第一轮设计 结果中约80％的设计蛋白能够折叠成稳定的空间结构。与此同时，约50％的设 计蛋白质溶解度低。基于这些实验结果，我们改进了设计方法，并进行了第二 轮设计。核磁共振谱图表明，该论设计蛋白在形成稳定三维结构的同时，溶解 度显著改善。 关键词：蛋白质设计、蛋白质折叠、定向进化、折叠协同性、蛋白质结构解析 摘要 H AbstractABSTRACT Abstract ABSTRACT The basic goal of the de novo designed proteins is about the de novo designed amino acid sequences to fold into desked structures which is way to reach more thorough understanding of how primary structure as amino acid sequences encode protein structures and decide the function．Notwithstanding several successful experimental validation examples，there are noteworthy limitations of the applications of computational protein design．The bottleneck of protein design is still the low design Success rate caused by not de印enough understanding of protein folding，not mat