神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚a对其作用的研究儿科学小儿外科专业论文.docxVIP

神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·中文摘要 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对 其作用的研究 中文摘要 研究背景 神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是4,A最常见的恶性实体肿瘤之一，占儿 童期肿瘤的8～10％，其恶性程度高，多数患儿最终愈后不良，故深入研究NB 的发生、发展机理至关重要。我们课题组在对NB的发生、发展机理进行研究 时发现：雌激素(estrogen，E)和环境雌激素双酚A(bisphcnol A，BPA)均能促进神 经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的增殖、侵袭和转移，即E和BPA均可促进NB 的发展。在此基础上，我们试图探寻E和BPA对NB起始环节的作用，而肿瘤 干细胞(cancer stem cell，csc)即属于肿瘤的起源细胞，故我们选择研究“E和 BPA对神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株的CSC的影响一来探寻“E和BPA对 NB起始环节有无作用。 研究目的 SP(sidc population，SP)分析法从神经母细胞瘤SK-N．SH细胞株中分离并鉴 定出CSC，明确E和BPA干预对SK-N．SH细胞株的CSC有无影响，最终了解 E和BPA对NB的起始环节有无作用。 材料与方法 一、SK-N．SH细胞株侧群细胞的检测及检测条件的优化：不同的Hoechst 孵育时间、不同的维拉帕米浓度检测SK-N．SH细胞株的SP细胞(侧群细胞)比 例，根据SP细胞的检测效果选择各自的最佳条件；不同浓度Hoechst染色后的 表型观察、CCK．8活细胞数评定了解Hoechst对SK-N．SH细胞株的毒性；不同 浓度Hoecllst染色后的流式细胞仪细胞周期分析、Annexin V．FITC和PI双标法 流式细胞仪凋亡及死亡分析、再培养后SP细胞比例的检测，探讨Hoechst对 SK-N．SH细胞株毒性的机理；最后对比不同浓度Hoechst对SK-N．SH细胞株的 SP细胞检测效果，选择出能有效检测SP细胞并最低毒性的Hoechst浓度。 二、SK-N．SH细胞株侧群细胞的分选及其干细胞特性的鉴定：流式细胞仪 于SK-N．SH细胞株中分选出SP细胞和非sP细胞(NSP细胞)；SP和NSP细胞 均分别接种于正常生长培养基和干细胞培养基中培养并传代，观察细胞表型的 变化；电镜观察SP和NSP细胞的超微结构；免疫荧光和免疫印迹法了解SP 和NSP细胞的干细胞和分化细胞标志物的表达；CCK．8分析了解SP和NSP细 胞的增殖能力；连续培养的SP和NSP细胞的表型观察、蛋白标志物表达及流 式细胞仪SP细胞比例再检测了解各细胞亚型的分化潜能；平板克隆实验、 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 神经母细胞瘤侧群细胞的干细胞特性鉴定及雌激素和双酚A对其作用的研究 博士论文·中文摘要 Transwell侵袭实验、裸鼠成瘤实验明确SP和NSP细胞的恶性程度。 三、雌激素和双酚A对SK-N．SH细胞株侧群细胞作用的研究：E2和BPA 干预后流式细胞仪检测SK-N．SH细胞株的SP细胞比例；E2和BPA干预后免疫 印迹法检测干细胞标志物c．kit和ABCG2蛋白的表达；CCK．8分析和流式细胞 周期分析确认E2和BPA对SK．N—SH细胞株的促增殖作用；CCK．8分析了解 E2和BPA对SK-N．SH细胞株的SP和NSP细胞各亚型的促增殖作用。 结果 一、SK-N—SH细胞株侧群细胞的检测及检测条件的优化：60min的Hoechst 孵育时间、501xmol／L的维拉帕米浓度可有效于SK-N．SH细胞株检测出SP细胞； SK．N—SH细胞株特异地对低浓度的Hoechst毒性反应敏感，其机理与Hoechst 干扰细胞周期、诱导细胞死亡和凋亡有关；对比不同浓度Hoechst的检测效果 和毒性，最终选择59M的浓度用于SK-N．SH细胞株的SP细胞分选；以上述的 检测条件检测出SK-N．SH细胞株的SP细胞比例为3．6±0．2％。 二、SK-N—SH细胞株侧群细胞的分选及其干细胞特性的鉴定：成功于 SK-N—SH细胞株中分选出SP和NSP细胞；SP细胞胞体小、有神经丝样突起， 贴壁能力弱、集聚性生长，核质比高、胞浆细胞器少，高表达干细胞标志物、 低表达分化细胞标志物，增殖速度快，具有快速分化能力，克隆形成能力强、 侵袭性高、裸鼠成瘤率高；SK-N—SH细胞株的NSP细胞胞体大、无神经丝样突 起，贴壁能力强、单层生长，核质比低、胞浆细胞器多，低表达干细胞标志物、 高表达分化细胞标志物，增殖速度慢，具有缓慢的分化能力，克隆形成能力消 失、侵袭性弱、无裸鼠成瘤能