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免疫组织化学方法
四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。 五、DAB有致癌性,用后不应随处倒弃。 免疫组织化学技术 免疫组织化学技术 基本原理 通过免疫学中抗原抗体结合反应,用特异性抗体(单克隆或多克隆)检测组织、细胞内相应的抗原物质,形成抗原 — 抗体复合物;此复合物上带有事先标记的标记物,通过与标记物相对应的检测系统,如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色,从而可检测组织细胞内的抗原,以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。 组织与细胞材料的制备 免疫组织化学方法 组织与细胞材料的制备 组织石蜡切片制作 组织冰冻切片制作 细胞爬片制作 细胞涂片制作 切片的制作 组织的固定 组织石蜡包埋 切片 目的: (1)防止组织细胞的死后变化,防止自溶和腐败,以保持组织细胞 的固有形态。 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶 性物质,以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的 死后变化,防止自溶和腐败,以保持组织细胞的固有形态。 (3)使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率,造 成光学上的差异,以便染色后易于鉴别和观察。 (4)固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制 片。 (5)防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。 (6)经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰,便 于辨认。 组织材料的固定 固定液的选择: (1)甲醛固定液:10%福尔马林,10%中性福尔马林,10%中 性缓冲福尔马林 (2)4%多聚甲醛固定液 (3)Bouin S液及改良Bouin S液 (4)Zenker S液 (5)Zamboni S液 (6)PLP固定液:过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂 较适合富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保 存较好。 (7)PLPD固定液 取PLP固定液25ml,加入2.5%重铬酸25ml。 (8)Kanovsky S液 (9)Methacarn固定液,对核内抗原的保存效果较好。 (10)PEG液 (11)0.4%对苯醌 (12)碳二亚酰胺-戊二醛(ECG-G)液 (13)丙酮及醇类固定剂 固定时间: 固定时间要视组织块的厚薄,固定液的种类及浓度,温度而定,原则上,组织块大小与固定时间成正比,固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 大组织:75%乙醇30~120min,85%乙醇30~120min,95%醇Ⅰ 2h,95%乙醇Ⅱ 2h,95%乙醇Ⅲ过夜,无水乙醇Ⅰ30 ~60min,无水乙醇Ⅱ30~60min,无水乙醇Ⅲ60min~120min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定),石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1~2h,石蜡Ⅲ2~3h。 小组织:75%乙醇30min,85%乙醇30min,95%乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h,无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min(肉眼观察),石蜡Ⅰ30min,石蜡Ⅱ30min,石蜡Ⅲ1~2h。 组织石蜡包埋 切 片 载玻片的清洁: 市售载玻片需经清洁液泡24h,流水冲洗,系列乙醇浸泡,凉干涂胶,如需开展原位杂交,还需将玻片240℃烤2h。 切片粘合剂的使用:(1)多聚赖氨酸(分子量300KD):0.5%浓度。(2)APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷) 干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂(1ml+50ml丙酮) 1~3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好,室温或4℃保存备用。 (3)铬矾明胶液:铬矾0.5g 明胶5g H2O2 1000ml (4)甲醛明胶液:40%甲醛2.5ml 明胶0.5g H2O2 100ml 切片: 石蜡切片: (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)52-60℃烤片18h。 (3)切片厚2~4μm。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4℃保存数年 冰冻切片: (1)冰冻切片分固定和新鲜组织,固定组织需经庶糖处理 24h,冰冻切片。 (2)冰冻切片后需凉干后立即固定 (3)冰冻切片固定后-80℃保存备用 细胞爬片制作 将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。 待细胞生长达到60%以上后取出玻片。 用4%的多聚甲醛固定2h以上。 可加甘油封存置于零下20度保存。 细胞涂片制作 离心将细胞收集出来,用预冷的PBS洗2-3遍,最后用PBS将细胞重悬。 吸取30-50ul(可根据
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