肾上腺受体β1亚型adrb1在肿瘤恶病质脂肪消耗过程中的作用和机制研究外科学专业论文.docxVIP

复旦大学博士学位论文 复旦大学博士学位论文 中文摘要 肾上腺素受体13 1亚型(ADRBl)在肿瘤恶病质脂肪消耗过程中 的作用和机制研究 中文摘要 第一部分 脂肪分解通路受体在肿瘤恶病质病人脂肪组织中的表达及临床 意义 目的：检测肿瘤恶病质病人和对照组病人脂肪细胞膜上脂肪分解通路受体的表达 情况，分析其与肿瘤恶病质病人脂肪分解增强的关系。 方法：共入组34例病人，其中肿瘤恶病质12例、肿瘤对照13例、良性对照9 例，术中收集腹部皮下脂肪组织标本。Real．time PCR方法检测肾上腺素受体p1 亚型(ADRBl)、。肾上腺素受体D2亚型(ADRB2)、肾上腺素受体p3亚型 (ADIm3)、肾上腺素受体ct2C亚型(ADRA2C)、心房钠尿肽受体A(NPRA)、 胰岛素受体(INSR)，以及激素敏感性酯酶(HSL)的mRNA水平。Western blot 测定ADRBl和HSL的蛋白水平；免疫组织荧光方法进行ADRBl蛋白定位。 结果：肿瘤恶病质病人脂肪组织中ADRBl和HSL的rnRNA相对水平比肿瘤对 照组和良性对照组升高约50％(尸=0．022；P=0．013)，而其他脂肪分解通路受体 的mRNA相对水平没有显著改变。恶病质组ADRBl蛋白相对表达量分别是肿 瘤对照组的1．5倍及良性对照组的3倍(尸0．001：P0．001)。免疫组织荧光检 测证实ADRBl蛋白表达于脂肪细胞膜。恶病质组HSL蛋白表达量是两个对照 组的2--,2．5倍(尸0．001；P=0．005)。ADRBl和HSL的蛋白相对表达水平呈 正相关(F0．474，P--O．005)。ADRBl蛋白相对表达水平与甘油三酯(triglyceride， TG)分解率呈正相关(FO．406，P=0．002；r=0．435，P=0．01)。 结论：肿瘤恶病质病人脂肪细胞膜上ADRBl蛋白表达增加，与HSL表达增强 和TG分解率增强呈正相关，提示ADRBl过表达可能通过激活脂肪分解通路导 致肿瘤恶病质病人脂肪消耗。 关键词恶性肿瘤；恶病质；脂肪分解；肾上腺素受体Dl亚型；激素敏感性酯酶 中图分类号R730．23 复旦大学博士学位论文 复旦大学博士学位论文 中文摘要 第二部分 基于3T3．L1前脂肪细胞株的人类ADRBl基因稳定过表达模型 的建立 目的：利用慢病毒载体，建立基于3T3．L1前脂肪细胞株的人类ADRBl基因稳 定过表达细胞模型。 方法：利用DNA重组技术将人类ADRBl eDNA克隆片段和慢病毒载体质粒 (pLVX．IRES．ZsGreenl)连接；将重组载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞， 在细胞中进行病毒包装；包装好的假病毒颗粒被分泌到细胞外的培养基中，质粒 感染48小时收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，直接用于感染3T3．L1前脂肪细 胞株，将ADRBl基因稳定转染进3T3．L1前脂肪细胞株。最后利用GFP流式细 胞分选技术筛选稳定转染细胞株进行培养，从而建立了基于3T3．L1前脂肪细胞 株的人类ADRBl基因稳定过表达模型。 结果：Western blot检测证明，ADRBl过表达组的ADRBl蛋白相对水平较转空 病毒对照组(mock组)显著增高，证明了含有ADRBl基因的慢病毒载体质粒 构建、慢病毒包装、慢病毒感染3T3．L1细胞、稳定转染细胞株筛选步骤均正确。 ADRBl基因随病毒DNA整合进宿主细胞基因组，使ADRBl蛋白在3T3．L1前 脂肪细胞膜上稳定过表达，基于3T3．L1前脂肪细胞株的人类ADRBl基因稳定 过表达模型构建成功。 结论：建立了基于3T3．L1前脂肪细胞株的人类ADRBl基因稳定过表达细胞模 型，使之模拟肿瘤恶病质病人脂肪细胞的特征性改变，为进一步研究ADRBl过 表达在肿瘤恶病质脂肪消耗过程中的作用奠定了模型基础。 关键词肿瘤恶病质：肾上腺素受体D1亚型；3T3-L1前脂肪细胞株；慢病毒载 体；基因转染 中图分类号R730．23 4 复旦大学博士学位论文 复旦大学博士学位论文 中文摘要 第三部分 脂肪细胞中ADRBl基因过表达对脂肪消耗的影响及其分子机制 目的：利用分子生物学实验手段验证临床标本检测实验所揭示的现象，进一步研 究ADRBl过表达在肿瘤恶病质脂肪消耗过程中的作用及其分子机制。 方法：设立control组、mock组、ADRBl过表达组、抑制剂干预组。利用MDI 方案诱导ADRBl稳定过表达的3T3．L1前脂肪细胞模型分化为成熟脂肪细胞， 通过油红O染色实验及Western blot检测422(aP2)蛋白水平，研究ADRBl过表 达对脂肪细胞分化的影响。利用Westernblot方法检测ADRBl和HSL蛋白水平， 研究ADRBl过表达对TG分解通路的影响：通过Western bl