植物生理生化实验.doc

PAGE PAGE 13 实验一 植物组织游离氨基酸含量测定—茚三酮试剂显色法 P199 原理：游离氨基酸与茚三酮共热时能定量生成二酮茚-二酮茚胺，产物呈蓝紫色，称Rubemans紫。其吸收峰在570nm，且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。 ①微酸、90℃：氨基酸被氧化形成CO2、NH3 ②脱水：还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚-二酮茚胺。 材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。 实验步骤： 分别取1g萌发、未萌发水稻于研钵中，加入5ml醋酸（使蛋白质变性，沉淀），研磨成匀浆后，用无氨蒸馏水稀释至100ml。用干燥滤纸过滤到三角瓶中。如下操作 试管编号 试剂 空白1 样品1（未萌发） 样品2（萌发） 2 3 4 5 样品提取液ml 0 2 2 2 2 无氨蒸馏水ml 2.0 0 0 0 0 0.1抗坏血酸ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 水合茚三酮ml 3 3 3 3 3 570nmOD值 0 0.130 0.123 0.188 0.168 每管含氮量 0 1.26 1.19 1．83 1.83 置于沸水中加热15min，取出用冷水迅速冷却并不时摇动，使之呈蓝紫色，用60%乙醇定容20ml，在570nm波长下测定吸光度。 样品氨基态含氮量（ug/100g鲜重）=CVT/VSW *100 ；C=A/k (k=0.103) ； VT=100/2 ； VS=1 ； W=1 注意事项： 测定前所用的玻璃仪器要干燥，所用的蒸馏水必须为无氨水； 样品要磨匀，用无氨蒸馏水定容，并用干燥滤纸过滤； 抗坏血酸易被还原；加入的量要严格控制，因为还原剂抗坏血酸会与茚三酮反应； 水浴锅的液面要高于试管内的液面，使其加热均匀，并在加热后几秒再塞上塞子，水浴锅温度要高于90℃ 稀释后要迅速比色； 6. 谷物等蛋白质样品可用酸水解法讲蛋白质水解后，用本法测定氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量； 7. 反应要在无水、有机、微酸的环境下进行。最适PH为4.5，是乙醇-乙酸钠缓冲液和醋酸缓和后的PH。 思考题： 茚三酮与所有氨基酸的反应产物都相同吗？为什么？ 不相同，因为有些氨基酸的结构不同，不含游离的氨基，如脯氨酸。 测定植物组织中游离氨基酸总量有何意义？ 可以测定植物对氮的根吸收，测定植物的病理和逆境状态和植物的营养、施肥指标等。 植物组织氨基酸的测定为什么要除去蛋白质？用10%乙酸出去蛋白质的原理是什么？ 因为植物组织中除了游离氨基酸外还有蛋白质，蛋白质会影响实验结果。 10%乙酸会使蛋白质变性产生沉淀而被过滤除去。 抗坏血酸在测定中的作用是什么？ 作用是保护还原型茚三酮，防治其被氧化。 722S型分光光度计使用：①空白，开启，透射比0%，关上，100%。②吸光度模式 实验二 植物组织可溶性蛋白质含量测定—Folin酚试剂法 P188 原理：Folin酚试剂法，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应。 ①碱性：蛋白质肽键与铜生成紫红色蛋白质-铜络合物。 ②络合物和蛋白质中氨基酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸的残基使Folin试剂（磷钼酸-磷钨酸试剂）还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物质。 在一定条件下，颜色深浅与蛋白质含量成正相关，其吸收峰在650nm，因此可用分光光度法测定其含量。 材料：清水浸种吸涨的水稻、清水浸种萌发两天的水稻。 实验步骤： 分别取0.5g萌发、未萌发水稻于研钵中+2ml蒸馏水+石英砂，充分研磨，+3ml蒸馏水，定容25ml，放置15min，过滤取上清液备用。如下操作 编号 1 2 3 4 5 6 未萌发 萌发 牛血清蛋白250ug/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 酶0.5 酶0.5 蒸馏水ml 1．0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.5 0.5 试剂甲ml 5 摇匀→室温下放置10min 试剂乙ml 0.5 迅速摇匀→室温放置30min 650nmOD值 0.000 0.112 0.154 0.255 0.474 0.551 0.167 0.237 蛋白质含量 0 50 100 150 200 250 71.8 104.8 样品蛋白质含量（mg/g鲜重）=XVTN/WVS *1000 ；VT=25；W=0.5；VS =0.5 注意事项： Folin酚试剂只有在酸性条件下才稳定； 试剂甲、试剂乙加入后需要迅速摇匀； 反应最适温度在25-30℃ 样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基类化合物均会产生干扰。 思考题： 请介绍几种常用的可溶性蛋白质测定方法，并比较其优缺点。 ①Folin-酚试剂法 优点：灵敏度大、操作简单 缺点：试剂难配置，易受柠檬酸等化合物干扰 ②考马斯亮蓝G-250法 优点