ph对小鼠肝炎病毒s蛋白构象变化机制的研究微生物学专业论文.docxVIP

中国医学科学院／北京协和医学院 中国医学科学院／北京协和医学院 硕士学位论文 2．3结果与分析 35 2．3．1 MHV A59野生型s蛋白在有受体或pH8．0没有受体存在的条件下均能发生构象 变化 35 2．3．2组氨酸突变的选择 ．37 2．3．3组氨酸突变对S蛋白表达的影响 ．38 2．3．4组氨酸突变对s蛋白构象及功能的影响 ．39 2．3．5组氨酸突变对受体介导的病毒的入侵的影响 ．40 2．3．6组氨酸突变对pH介导的膜融合的影响 ．．41 2．3．7组氨酸中芳香环的结构对pH介导的细胞融合情况的影响 一43 2．4讨论 45 第三章全文总结 ．47 3．1结论 47 3．2研究中的不足及进一步待解决的问题 47 参考文献 48 附录一MHV S蛋白基因序列 53 附录二英文缩写词对照表缩略语 ．55 致谢 ．．56 个人简历及所发表的文章 58 万方数据 中国医学科学院／．11：京协和医学院 中国医学科学院／．11：京协和医学院 硕士学位论文 pH对小鼠肝炎病毒S蛋白构象变化机制的研究 摘要 冠状病毒是是己知RNA病毒中基因组最大的包膜病毒，在人类、其它哺乳动物 类以及鸟类中广泛传播；近十几年来，冠状病毒已经引起两次世界范围内的流行： SARS—CoV和MERS．CoY，死亡率较高，严重威胁人类健康及生命安全。冠状病毒 的感染是由刺突蛋白S与受体相互作用介导的，而S蛋白是宿主中和性抗体的主要 靶分子，由s1亚基和S2亚基构成，S1负责受体的结合，S2亚基介导病毒包膜与 细胞膜之间的融合；一般认为，天然的S蛋白处于一个亚稳定状态，当S1与受体 结合之后会发生一系列构象变化，然后S1解离，S2亚基上的膜融合肽暴露插入到 细胞膜，随后S2亚基上的两个7肽重复序列形成六螺旋束结构，最终导致膜融合。 S2发生的一系列构象变化的机制相对清楚，但S1跟受体结合后是怎样发生构象变 化以及构象变化的信号是怎样传递下去并最终介导膜融合的机制是不清楚的。前期 的研究表明小鼠肝炎病毒中在pH8．0、没有受体诱导的条件下，S蛋白发生构象变 化并高效介导非受体依赖的细胞膜融合(receptorindependent syncytia，RIS)，并且 DH8．0诱导的S蛋白构象变化跟受体诱导的S蛋白构象变化非常类似。因此，这正 好为我们研究受体介导的s蛋白发生构象变化提供一个相对简单的研究模型，为进 一步阐明冠状病毒感染机制提供了便利的条件。 本课题旨在研究没有受体的条件下，pH8．0诱导S蛋白发生的RIS的具体的分 子机制。文献报道，组氨酸的pKa值接近中性，是唯一一个pKa值接近中性的氨 基酸，在流感病毒中已经证明组氨酸的质子化可以引发HA蛋白的构象变化。因此 我们对MHV A59中的所有组氨酸进行了突变，然后研究突变体在pH8．0时是否还 能够介导RIS，以此来判断该组氨酸在pH诱导的构象变化中的作用。我们发现S蛋 白中179、209、441、643、759位置的组氨酸对pH诱导S蛋白RJS的过程中发挥 着重要作用，然后我们进一步研究组氨酸的芳香环结构在pH诱导的S蛋白介导的 RIS中的作用，我们将179、209、441、643、759位置的组氨酸突变成苯丙氨酸， 发现759位置的芳香环在s蛋白介导的RIS中起着重要作用，但由于苯丙氨酸不受 pH影响的特性，我们排除759位置的组氨酸作为pH sensor的可能。 综上所述，我们发现MHV A59 S蛋白179、209、441、643位置的组氨酸在pH8．0 诱导的RIS中起着关键作用，是主要pH sensor，同时组氨酸芳香环在pH诱导的S 蛋白介导的RIS过程中也发挥了一定的作用。 关键词：冠状病毒，小鼠肝炎病毒，刺突蛋白，癌胚抗原相关黏附分子 万方数据 中国医学科学院／北京协和医学院 中国医学科学院／北京协和医学院 硕士学位论文 rn● l ne mecnauism researcli 0I sDIRe oroteln COnlormatl0Ual change mediated by pH in murine hepatitis virus Abstract Coronavirus(CoV)is an enveloped plus-stranded RNA virus with the largest genome among all known RNA viruses．CoVs infect varieties ofspecies including humans， other mammals and birds，and cause different diseases．Since 2003，there have been two global outbreaks