嗜热微生物中天然质粒的筛选鉴定与穿梭载体的构建微生物学专业论文.docxVIP

第一章综述摘 第一章综述 摘 要 嗜热菌是指一类能够在55℃以上温度下正常生长和繁殖的细菌群体。本 研究以来源于腾冲温泉中的天然菌样为研究对象，从中筛选出含有天然质粒的 嗜热菌株，对筛选出的天然质粒进行测序和分析，并利用生化及分子的方法鉴 定该含有天然质粒的嗜热菌株。同时对本实验室构建的高效热激表达载体 pHsh进行改造，为进一步构建穿梭质粒奠定基础。 本文利用高温下平板筛选的方法获得嗜热菌株，进一步将各个单菌落分别点 样，以SDS蛋白上样缓冲液破细胞的方法破除细胞壁，所得样品进行凝胶电泳， 获得1株带有天然质粒的嗜热菌，该天然质粒琼脂糖凝胶电泳大小约为7．9 kb。 对该菌株进行革兰氏染色及芽孢染色，初步确定为革兰氏阳性的芽孢杆菌。随后 分别用几种常用限制性内切酶对质粒进行酶切，将酶切所得片段分别克隆至 pUCl9上，测序结果与NCBI比对，发现其与地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifo册括)中发现的天然质粒pFL7、pFL5具有相当高的同源性。继而对宿主 菌进行16S rDNA克隆测序，比对得到相同的结果。为进一步确定宿主菌株， 对其进行了BIOLOG微平板系统检测，检测结果表明该宿主菌株为热葡糖苷酶 芽孢杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)。通过分时取样测OD的方法分别测 定该宿主菌在高温区间(45～62℃)和低温区间(30,--,45C)各温度梯度的生长曲 线，得知在高温区间，其在53℃有最大OD值，而在56℃有较长的平稳期， 并且倍增时间最短；在低温区间，其在37℃有最大OD值，并且倍增时间最 短，而在30℃有较长的延滞期。 本文通过PCR扩增相同大小特异性片段的方法，以基因组上特异基因为对 照，粗略估计筛选到的天然质粒拷贝数，结果证明该天然质粒在细胞中仅存在 2---3个拷贝，为低拷贝质粒。结合DNA分析软件，根据NCBI已经公布的地 衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifo朋括)中发现的天然质粒pFL7的序列设计PCR引 物，以筛选到的天然质粒为模板分段PCR，将PCR产物克隆至pHsh载体上， 通过测序获得该天然质粒的全基因序列。同时对pHsh进行基因改造，将其上 的氨苄青霉素抗性基因换成耐高温的氯霉素抗性基因，并将原本氨苄青霉素抗性 基因所识别的大肠杆菌强启动子换成由大肠杆菌G70专门识别的标准启动子，使 第一章综述氯霉素抗性基因得以高效表达，并且测定了该氯霉素抗性质粒转化的大肠杆菌 第一章综述 氯霉素抗性基因得以高效表达，并且测定了该氯霉素抗性质粒转化的大肠杆菌 JM 109在不同抗性浓度条件下的生长曲线。为了避免片段过大对克隆效率有影 响，通过定点突变的方法将pHsh的转录起始碱基由A突变为G，使其成为低 拷贝质粒，减轻对宿主菌的伤害，为进一步构建包含该天然质粒和pHsh的穿 梭质粒乃至建立嗜热菌的遗传转化系统奠定基础。 关键词：嗜热菌；穿梭质粒；定点突变；pHsh；天然质粒；遗传转化 Ⅱ 第一章综述Abstract 第一章综述 Abstract Thermophiles are a group of bacteria which carl grow and proliferate normally at the temperature over 55C．This research obtains a nature thermophile with plasmid from indigenous flora in the TengChong hot springs．We do the sequencing of the plasmid in the thermophile and analyze it．Making use of the bio-chemical method authenticates the thermophile with plasmid．The pHsh which sets up to this laboratory was carried on a reformation at the same time for setting up a new shuttle vector． This text makes use of the method with fiat panels under 550 to obtain thermophiles．Fall each single germ to inoculate to the new fiat panel．The sample which passes the method that the SDS breaks cell wall to acquir carries