耳叶水苋对als抑制剂的抗性及其als基因表达研究植物保护;农药学专业论文.docxVIP

。Classified 。Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)：no NO．：120310223 Dissertation for the Master Degree Study on Resistance to ALS Inhibitors of AMMANNIA ARENARIA H．B·K and the Expression of ALS Gene Candidate：Liu Bing Supervisor：Professor Liu Yaguang Degree Category：Master ofAgriculture C ollege：Agriculture First level discipline：Plant Protection Second level discipline：Pesticide Science Harbin China June 2015 万方数据 目录目 目录 目 录 摘要 I 英文摘要 III 1引言 一1 1．1稻田杂草的发生、危害与治理概况 ．．1 1．1．1稻田杂草的种类及其危害 ．．． 1 1．1．2稻田耳叶水苋的发生与危害 1 1．1．3稻田杂草的综合治理 ．．： 3 1．2杂草对除草剂的抗性研究进展 ．．4 1．2．1杂草抗药性的发展概况 4 1．2．2杂草对除草剂的交互抗性与多抗性 6 1．2．3杂草的抗药性机制 8 1．2．4抗药性杂草治理 9 1．3实时荧光定量PCR技术与杂草抗药性研究 10 1．3．1实时荧光定量PCR的简介 ．10 1．3．2实时荧光定量PCR技术与杂草抗药性机理研究 ．10 1．4本论文研究目的与意义 ．．． ．1 l 1．5本研究的技术路线 ．．． ．．12 2材料与方法 ： ．13 2．1供试材料 一 1 3 ．2．2耳叶水苋对ALS抑制剂的交互抗性测定 13 2．2．1供试药剂 。 一13 2．2．2抗性测定 ．．13 2．2．3数据处理方法 ．14 2．3耳叶水苋抗性生物型与敏感生物型ALS基因DNA序列分析 14 2．3．1供试耳叶水苋的培养 ．14 2．3．2菌株与载体 ～14 2．3．3主要仪器设备 ．14 2．3．4常用培养基和溶液配制 ．1 5 2．3．5耳叶水苋总RNA的提取 ．15 2．3．6耳叶水苋总RNA的检测 ．16 2．3．7耳叶水苋总RNA的电泳检测 ．16 2．3．8耳叶水苋eDNA第一链的合成 16 2．3．9常规PCR引物的设计与合成 ．17 2．3．10耳叶水苋ALS基因中间片段的扩增 18 2．3．1 l RACE法扩增耳叶水苋目的基因cDNA末端 ．20 万方数据 东北农业大学农学硕士学位论文 东北农业大学农学硕士学位论文 2．3．12耳叶水苋ALS基因全序列分析 22 2．4耳叶水苋抗性与敏感性生物型ALS基因表达的差异研究 22 2．4-1供试药剂及生化试剂 ．22 2．4．2供试植物 ．．22 2．4．3主要仪器 ．．22 2．4．4 RNA的提取及反转录 ．．23 2．4．5内参基因与目的基因的引物设计 ．23 2．4．6内参基因与目的基因的常规PCR验证 ． 24 2．4．7内参基因与目的基因的融解曲线分析和引物的扩增效率验证 ．24 2．4．8耳叶水苋不同生物型ALS基因的表达差异分析 ．25 3结果与分析 ．26 3．1耳叶水苋对四种ALS抑制剂交互抗性的测定 26 3．2耳叶水苋抗性与敏感生物型ALS基因的DNA序列分析 28 3．2．1耳叶水苋总RNA的纯度与完整性分析 ． ．28 3．2．2耳叶水苋ALS基因保守片段的扩增和序列分析 29 3．2．3耳叶水苋ALS基因cDNA 5 7端RACE法扩增 ．．30 3．2．4耳叶水苋ALS基因cDNA 3’端RACE法扩增 ．．31 3．2．5耳叶水苋ALS基因全序列的获得与分析 一 ．32 3．3耳叶水苋抗性与敏感性生物型ALS基因差异表达 33 3．3．1荧光定量PER中内参基因的克隆与鉴定 j 一j ． 33 3．3．2荧光定量PCR中目的基因与内参基因引物的设计与验证 ．33 3．3．3目的基因与内参基因的融解曲线分析与扩增效率验证 ．．34 3．3．4苄嘧磺隆抗性与敏感耳叶水苋生物型在ALS基因表达的差异分析 ．34 4讨论 ．j ．? ．． 36 4．1耳叶水苋不同生物型对4种ALS抑制剂的交互抗性 36 4．2耳叶水苋不同生物型ALS基因的DNA序列分析 36 4．3实时荧光定量PCR内参基因的选择 ．．． 37 4．4耳叶水苋对苄嘧磺隆的抗性与ALS酶过量表达的相关性 38 5结论 39 致谢 一 ．．4l 参考文献 42 攻读硕士学位期间