植物人工微rnaamirna表达载体构建的方法学研究及义其应用.docx

植物人工微妣～(蛐il州A)表达载体构建的方法学研究摘要 植物人工微妣～(蛐il州A)表达载体构建的方法学研究 摘要 人工微RNA(枷ficial microRNA，amiRNA)是在天然miRNA前体序列的基础 上，按要求替换其中的miRNA及其互补区域，然后在生物体内按照mi对蛆的生物 合成途径而形成的外源小RNA分子。锄iRNA的高效、高特异性以及无离靶效应的 优点已经在多种植物中被证实，并被公认为是继hpRNAi技术之后的第二代植物基 因功能研究工具。 尽管如此，由于舭liRNA前体结构的特殊性，人们构建amiI矾A表达载体均过 程繁琐且费用昂贵。为了解决这一问题，让amiRNA技术在植物研究中应用更加广 泛，本研究建立了三种新颖、简单、高效、低成本、高通量的植物锄iRNA表达载 体构建技术： 1．基于一步PcR的无酶克隆和MAGIc的amiI矾A表达载体构建技术 首先通过本室创建的无酶克隆载体构建技术，构建了三个含有相应锄iRNA表 达单元的供体质粒 pDonor-amiR3 19aFLcl、 pDono卜觚1iRl59aPDs 和 pDonor．锄iRl64aE眦，然后通过接合辅助的遗传整合克隆(mating．assisted genetically integrated cloni】唱，MAGIC)方法将锄iRNA表达单元分别转移至植物双元表达载体， 获得三个锄iI斟A表达载体p1301．amiR3 19aFLcl、p1301．锄iRl59aPDs和 p1301．锄iRl64a靴。将三种amiRNA表达载体分别转入拟南芥，Tl代阳性苗均出 现了与预期一致的表型；Real．time PCR分析表明，转基因拟南芥中的．肛J和P加2 基因的表达量明显下降：同位素32P标记示踪也检测到了转基因拟南芥中 锄iR319aFLcl和锄iRl64aE眦的存在。我们利用该方法构建了油菜锄i对峪表达载 体180多个，成本大大低于现有的锄iRNA载体构建技术，测序结果分析表明，该 方法获得锄iRNA表达单元的一次性成功率在70％以上。 2．基于缸cD重构的蓝白斑筛选和MAGIC的植物amiRNA表达载体构建技术 首先通过重构艮配D(共20bp)的方式，将携带7bp 7口cD序列的锄iR319aCHs 前体克隆至末端含有13bp妇D序列的载体pD3 19a-g邱(T)；然后通过直观快捷的 蓝白斑筛选方式，获得含有供体质粒pD(T)．miR3 1 9acH8的蓝色重组子；接下来通过 MAGIC方法将锄iR3 19aCH8表达单元转移至植物双元表达载体，获得锄iRNA表达 载体p1301(T)．miR319aCHs。将锄iR319acHs表达载体分别转入拟南芥，T1代阳 性种子出现了与预期一致的表型；Real．time PCR分析表明，转基因拟南芥中的c凰 华中农业大学20lO届博士研究生学位论文基因的表达量不同程度地下降。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体40 华中农业大学20lO届博士研究生学位论文 基因的表达量不同程度地下降。我们采用该方法构建了水稻amiRNA表达载体40 多个，对amiRNA表达单元测序分析表明，该方法获得anliI矾A表达单元的一次性 成功率在90％以上。 3．基于多引物直接退火的植物amiRNA表达载体构建方法 首先按照预先设计好的miR528PDs， nliR528Spl¨和miR528Eu‘1的前体序列，设 计并合成三组长度为40～50nt的引物(8条／组)，每组引物各自退火；经改造获得 的表达载体pYHl301·g币经翩力dIⅡⅣcD I双酶切、T4 DNA聚合酶外切处理，然后 与上述退火产物分别混合，直接转入大肠杆菌，获得锄iRNA表达载体 pYHl301．miR528PDs，pYHl301．miR528splll和pYHl301．miR528Eu订。我们采用该方 法构建了水稻amiI心『A表达载体20个，测序结果表明，该方法获得锄iRNA表达 单元的一次性成功率为100％。这是目前为止所有已知的植物锄iRNA表达载体构 建方法中，操作最简单、成本最低廉、效率最高的一种。 关键词：miRNA：锄iRNA；载体构建；无酶克隆；同源重组；MAGIC；，口cD重构 n 植物人工微RNA(锄il玳A)表达载体构建的方法学研究Abstract 植物人工微RNA(锄il玳A)表达载体构建的方法学研究 Abstract AmiRNAs(anificial miRNAs)are exogenous small RNAs generated by endogenous miRNA precllrsorS，which substitites miRNA觚d its complem