第3章 核酸提与鉴定.pptVIP

核酸的提取与鉴定 第一节 预处理 一、样品预处理 1、组织 组织有新鲜组织、甲醛固定或石蜡包埋组织。 新鲜组织先用生理盐水洗，然后将其捣碎或剪碎，加液氮研磨成粉状，加细胞裂解液裂解细胞； 甲醛固定组织要先去掉甲醛； 石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。 二、提取用具预处理 1、提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备 塑料制品：使用灭菌的一次性用品。或用0.1％DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)。 玻璃用品： 使用前于180℃的高温下干烤6h以上，或在220℃下干烤3h以上。 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3％H2O2室温浸泡10min，然后用0.1％DEPC水冲洗，晾干。 所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。 2．RNA提取中RNase污染的控制 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。 一、DNA的常规提取 1、酚-氯仿提取法 2、浓盐法 核糖蛋白（RNP）与脱氧核糖蛋白（DNP）在不同浓度的NaCl溶液中溶解度显著不同。DNP 在0.14mol/L NaCl溶液中溶解度最小，仅为水中的1％。 当NaCl浓度增至1mol/L时，DNP的溶解度比在水中大2倍。利用这一性质可将DNP从破碎后的细胞匀浆中分离出来，也可以使DNP和RNP分离， DNP的蛋白部分可用苯酚、SDS等其他方法将其除去。 3、玻璃棒缠绕法 用盐酸胍裂解细胞，然后将细胞裂解物小心铺在离心管中的乙醇上，用一个代沟的或前端为U型的玻璃棒在这两层溶液的交界面慢慢搅动，沉淀出的胶状DNA缠绕在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA经多次乙醇浸泡并与室温下蒸发乙醇，由胶状逐渐回缩，然后浸入TE缓冲液中，使其重新吸水膨胀而和玻璃棒分离。 4、玻璃颗粒吸附法 首先利用含异硫氰酸胍的细胞裂解液裂解细胞，然后加入能够与DNA结合的玻璃颗粒的缓冲液，经沉淀收集结合DNA的玻璃颗粒，利用洗脱液进行洗脱获得DNA。不仅玻璃颗粒可以和DNA结合，一定大小的硅胶颗粒也可以和DNA结合。 二、质粒DNA的提取 质粒DNA的提取有效方法 方法：碱裂解法；氯化铯密度梯度分离法；煮沸裂解法等。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。 EB分子可嵌入碱基对之间，使DNA解旋 开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋，可结合大量EB，DNA-EB复合物含EB越多，密度越小。 闭环质粒DNA没有游离末端，不易解旋，结合少量EB，密度较大。 在饱和EB条件下，质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNA 。 通过加热，使细菌裂解、蛋白质和染色体DNA变性。 降低温度，闭环质粒DNA复性留于上清液，染色体DNA不能复性与变性蛋白质形成沉淀，可通过离心出去而分离。 第三节 RNA的提取 一、总RNA的提取 常用的RNA酶抑制剂 ①焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。 ②异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂。 ③氧钒核糖核苷复合物 ④RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin) ⑤其他：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 RNA的提取方法 1、异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法 使用蛋白质强变性剂异硫氰酸胍裂解组织和有效抑制RNA酶的活性，再进行CsCl密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清液中。 使用这种方法，不但能得到高质量的RNA，而且能同时分离出细胞染色体DNA。本法已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。 2、盐酸胍-有机溶剂法 盐酸胍变性蛋白质，抑制RNA酶，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。此法适用于没有超速离心设施的情况下提取细胞总RNA，提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。 3、氯化锂-尿素法 利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶， 氯化锂选择性沉淀RNA。 其缺点是有时会存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA，如5sRNA等。优点是快速、简便、产量高，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取。 4、一步快速热酚抽提法 将异硫氰酸胍、巯基乙