产甲基丙二酰辅酶a的假单孢菌菌株和德胺糖表达载体的构建微生物学专业论文.docxVIP

囊褒瘘范犬学蘸毒学餐论文 囊褒瘘范犬学蘸毒学餐论文 产荦莲秀=懿辅懿A翡骰单麓蔼麓撩 和德胺糖表达蛾体的构建 产甲基丙二酰辅酶A的假单孢菌菌株和德胺糖表达载 体的构建 中文摘要 聚隔纯含物是一大类结构多样性的天然产物，并广泛应蠲予治疗学，禳多聚 酮他合物需要以警基嚣二酰辅酶A(mm-CoA)作为整会C3单嚣酶延伸单位。 mm—CoA可以通过两条途径合成：PCC(丙酰基CoA羧化酶)途径，该途径由 两个基因：accAl和pccB组成，accAl基因编码丙酰基辅酶A羧化酶的Q距单 元，pccB基因编码羧基转移酶亚单元；MCM途径，MCM基因簇由三个开放阅 读框组成，鄙mm—CoA变位酶(MCM基因)、差向异构酶(epi基因)和麟 共同完成。 嫣PCR的方法克隆MCM基因簇，放Escherichia coil(大肠杆菌)孛扩增 mm-CoA变位酶基因和ArgK基因，放Streptomyces coelicolor A3(2)(天蓝色链 霉精)中扩增差向异构酶基因；同时从Pseudomonas putida KT2440(恶臭镁单 胞菌)中扩增两段同源区域：left基因和right基因(1eR基因位于gph基因左侧， 包含rpe基因，长度为lkb；right基因位于gph基因右侧，是卸E基因的一部分， 长度为1．0kb)；苏pACYCl77为摸板扩增卡那霉素抗饿基因(Kan抗性基因)， 长度秀1．0kb，黻上六个基毽，颓痔为：left-kan-印i*mcm-argK-right，这样MCM 基因簇处于Kan抗性基因启动子的驱动，将所约建静基嚣盒克隆刭置putida KT2440转化载体pEXl00TLinK。该载体会有蔗糖敏感型受筛选标记SacB基因， 当禽有MCM基因簇的质粒通过结合转移的方法异源表达到p putida KT2440， 同源区域两端发生双交换，MCM基因簇被整合到冀putida KT2440基因组DNA， 同对也有发生单交换的情况，单交换的菌株pEXl00TLinK也被整合到置putida KT2440基霞缀DNA中，壶予SacB基爵的存在，单交换的菌株不能在含有蔗糖 的培养基孛生长，因此，结合转移熹转化子经蔗糖蕊选磊长毒蠹冬多数是双交换的 菌株。 PCC基因簇由薅个基因组成：accAl和pecB。aeeAl基因和pecB基因都来 源于S．coelicolor。用同样的方法克隆抗性基因和同源区域，共五个基因，顺序为： lefl-kan-aeeAl-pccB—right，克隆到r putida KT2440中转化载体pEXl00TLinK， V 囊寨爨戆犬攀磺士学燕论文 囊寨爨戆犬攀磺士学燕论文 产警萋嚣：蕺辘酶A静骰莘麓麓蘸濂 和德脓糖表达载体的构建 褥样方法筛选转化子并验证。 MCM基因簇和PCC基因簇异源表达到震putida KT2440中。对予疆知基因 簇异源袭达可以选择拔coil，S．1ividans．Pputida．B．subtilis，很明显每个系统都 有箕局限缝，医就蔫效的表达一般都发生在与基嚣簇褶近韵徽生物。藏线菌及相 关翡链霉蘸楚被庭震最广泛熬异源表达体系，医为它稻麓提供蒙黧佬合物生物合 成全部的装餐，藤且多数已知的次缀代谢产物生魏食残基因簇都涨鸯该摄。炎肠 杼蓥也是颇受欢逮的异源表达体系，毽蠹它是匿前遗传学上的王其、煮成熟鹣发 酵方面知识、易予操作，但是它也有很多缺点，如岛多数生物合成基因簇比有不 同的Cr+C含照。在放线菌和E．coli间的差距可以豳Pputida来弥补，Pputida产 生的PKS／NI／．PS杂环分子是天然产生煞五倍，发簿时灏却缩短了三倍。Pputida 拥有E．coli嬲优势，魏赫予搡箨、遗传学工具、可姚的生长率；也有效线蔼的特 性，像簿的G+C含量、簸产生次级戴谢产物。。 MCM基壤簇耨PCC基嚣簇异滚表达熊耋缝畿株通过GCFMC鹃方法进行分 析。甲基瓣：酸盐及其CoA蘸誉爨丁簿反应爱生成攀基露二酸的=T基蘸 (mmdiBE)，mmdiBE通过GC／MS定爨分析。 格尔德霉素(Geldanamyein，GA是一种苯醚安莎类抗生索，它耧ATP竞 争结合热休克蛋鸯Hsp90的ATP结合位点，影响Hsp90的功熊。从药效角度来 看，在几种入类癌痰孛，Hsp90奔导鹩爨蠢在信号鞴导和转录串霄重要作用，这 种治疗靶赢还没有装运耀。露此毒；起入髑磅竞GA鳃极大地兴趣，并将GA及箕 类似物列为潜在的撬癌药物。但其具有较强的肝毒性，箍显水添性逛不好，在有 机溶剂溶解状态下稳定性差，且见光易分解，对热、酸、碱均不稳定，所以需要 对箕结构进行褶应教造，寻找毒性鞠活链更好的衍生物。 对GA的结构改造主器通过生物学方法和讹学方法，通过生物学方法改造化 合物翁结构，戈其特殊静忧势；首