第八章 已知基克隆1.pptVIP

第八章 已知序列基因的克隆 二、目的DNA片段的克隆 （一）目的DNA片段与载体的连接 1、连接酶 2、连接方式 全同源粘端：外源DNA片段两端与载体DNA片段两端具有完全相同的同源互补末端，他们之间的连接称为全同源粘端连接。 定向克隆：外源DNA片段定向插入到载体分子中的一种连接方式。 （二）重组DNA分子转入宿主细胞的方式(转） 在体外组装的DNA重组分子只有转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。 转入方式随载体的不同而不同，转移技术包括：转化、转染、显微注射及脂质体介导转移等。 1、转化（transformation）和转染（transfection） （1）化学法转化原理：低温下CaCl2处理细菌处于感受态，DNA分子形成羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，42℃短时间热处理，细胞吸收DNA复合物。 转化效率：105～106个转化子／ugDNA（CaCl2法）。 应用：可满足一般的基因克隆试验。 一、针对遗传表型的变化筛选 1、按载体的性状变化进行筛选 2、根据插入基因的遗传性状进行筛选 2、根据插入基因的遗传性状进行筛选 已知克隆基因所编码蛋白的功能，且蛋白为细菌的生命活动所必需时，可用该法筛选。 如：Leu缺陷型，培养基中加Leu 如果克隆基因是合成Leu的基因时，可以用