杜氏藻分子系统学分析pds基因的克隆与分析及初步应用rnai的基因功能研究海洋生物学专业论文.docxVIP

录号为DQ845248。对序列信息进行了详细的分析， 录号为DQ845248。对序列信息进行了详细的分析， Southem bloRing结果显示 pds基因在杜氏盐藻基因组中存在一个拷贝，应用半定量RT-PCR的方法对该基 因在藻生长过程的各个阶段的表达情况进行了分析。 探讨了电激转化盐生杜氏藻的条件，并实现了质粒pBl211∞m的瞬时表达。 采用了两种电激模式．高电压低电容模式下3-7 kV／cm和低电压高电容模式下 300—500 V／cm，对盐生杜氏藻细胞转化质粒后，从多个方面动态检测了转化效果。 实验组细胞数量与对照组于第四天起有差异，实验组活细胞数量多于对照组 (p0．05)，未加质粒的对照组第16天细胞存活很少，20天后完全死亡，加质粒 的实验组死亡速度明显慢于对照组(pO．05)；转化后16天内实验组细胞PCR 扩增检测cat基因部分序列结果呈阳性：组织化学染色法检测GUS基因表达， 有蓝色反应；由此推断，质粒pBl221．cat在盐生杜氏藻中表达，因此具有氯霉 素抗性并表达B一葡糖苷酸酶。 转化实验组盐生杜氏藻细胞24天后最终全部死 亡，说明表达为瞬时，PCR和GUS组织染色也证明质粒的存在和表达为瞬时。 为下一步在盐生杜氏藻中实现以RNAi的方法研究基因功能提供实验基础。 在前面工作基础之上，pBl221．eat为基础，插入正反向重复序列，构建表达 双链RNA的RN鼬表达载体。首先在载体pBl221一cat的SmaI和Bspl407I单酶 切位点之间插pds基因328bp的正向片段和368bp闻隔序列，得到中间载体 pBIRNAI—Ds，鉴定正确之后插入328bp反向序列。最后测序证明，表达载体 pBIRNAI—Dsa构建成功。构建成功载体以电激的方法转入盐藻细胞，以非双链表 达载体pBl221．cat为对照，荧光实时定量PCR的方法测定电激后pds基因的表 达，以2-触6法来处理数据，表示目的基因的表达相对改变量。数据显示，较 转入对照载体pBl221．cat的对照组而言，转入干涉载体pBIRNAI．Dsa的实验组 的pds基因表达显著下降，说明pds基因的表达受到抑制。在杜氏盐藻中建立以 RNAi研究基因功能的方法，为有效研究其耐盐机制提供快速有效工具。 关键词：杜氏盐藻； RF--RA眠八氢番茄红素脱氢酶；电激；R№ 干扰 V111 Molecular Molecular phylogeny analysis of Dunaliella,pds gene cloning and gene function research by RNAi method Abstract Dunaliella salina,weU-known for its ability of growing in hi曲salinity environment and the ability to accumulate large amounts ofcarotenoids under various stress conditions，make it fin important model organism tO investigate the molecular mechanism of the earotenoids biosynthesis and accumulation and the molecular mechanism ofits resistibility to wide range ofsalinifies． In this paper,genetic relationships of 10 strains ofDunaliella we】le studied by the innovative method of combination of RAPD and restriction endonuelease e11zylne digestion(Restriction Fragment—Random Amplified Polymorphic DNA,RF-RAPD) techniques．22 from 28 primers scanned gave total 190 clear and reproducible bands， 1 85 of these were polymorphic．Ten strailrlS of DunalieUa were classified into three groups．Two Beijing strains ofD．salina(D，salina OUC2 and D．salina OUC3)were highly simimr,and were group