功能化自组装多肽激活人骨髓间充质干细胞及延缓兔椎间盘退变的实验研究外科学专业论文.docxVIP

博士学位论文作用的情况下，KPSS促进细胞增殖的能力最强，但成骨能力最弱。本课题组前 博士学位论文 作用的情况下，KPSS促进细胞增殖的能力最强，但成骨能力最弱。本课题组前 期将BMP．7的三种生物活性片段分别加载至自组装多肽纳米纤维材料 RADAl6．I的C’末端，组成功能化自组装多肽纳米纤维材料RADA．SNVI， RADA．KPSS，RADA．KAIS。再将三种功能化自组装多肽纳米纤维材料与 RADAl6．I以1：1体积比例混合后制成新型混合功能化自组装多肽纳米纤维材料 RADSNV、RADKPS、RADKAI。在综合比较之后，体外研究发现载有KPSS片 段的RADKPS促进椎间盘内源性细胞分泌AGG及COLII的能力最强，且作用 持续时间较单独使用BMP．7长。然而，对于RADKPS对BMSCs的趋化迁移分 化作用及其在体内延缓椎间盘退变的作用尚缺乏相应的研究。因此，在前期研 究基础上，本研究拟进一步探究RADKPS的体外及体内生物学作用：1、探究 RADKPS体外趋化募集人BMSCs的作用，并利用椎间盘器官培养模型模拟 RADKPS在椎间盘内促进人BMSCs从终板迁移至髓核的过程。2、探究RADKPS 对人BMSCs增殖及向髓核样细胞分化的作用。3、将RADKPS注入兔退变椎间 盘内，观察其延缓椎间盘退变的作用，同时予以静脉注射PKH26标记的人 BMSCs，观察RADKPS在体内促进BMSCs向椎间盘内趋化迁移的作用。 第一章RADKPS体外对入BMSCs趋化迁移的影响 目的：通过Transwell小室模型及牛尾椎间盘器官培养模型观察RADKPS 在体外对人BMSCs的趋化迁移的影响。 方法： 1．委托杭州中肽生化有限公司合成RADAl6．I及复合有BMP．7功能片段的 RADA．KPSS。将两种多肽粉末(RADAl6．I／RADAl6．KPSS)以质量体积比为 10％的蔗糖水充分溶解，得到浓度均为lmg／mL的两种多肽溶液。将RADAl6．I 与RADA．KPSS以等体积比例混合得到RADKPS溶液。在24孔板的孔中加入 400此／孔无血清培养基(serum free dulbecco’s modified eagle medium， SF．DMEM)。再将Transwell小室放置于孔中，分别于每孔中加入100此体积的 III 万方数据 摘要RADAl6．I或者RADKPS溶液，置于培养箱中孵育30 摘要 RADAl6．I或者RADKPS溶液，置于培养箱中孵育30 min后观察成胶性能，再 通过HE染色观察水凝胶的组织学结构。 2．通过梯度离心法分离人原代BMSCs，体外扩增培养获取P3代人BMSCs， 经三系诱导分化(成骨、成脂肪、成软骨诱导)后，茜素红染色、油红O染色 及COLII免疫细胞化学染色鉴定成骨、成脂及成软骨分化能力，将P3代人 BMSCs用SF．DMEM制成细胞悬液备用。 3．利用Transwell小室模型体外探究RADKPS趋化迁移人BMSCs的能力。 实验分为三组：RADKPS组、RADAl6．I组、SF．DMEM组，在24孔板的每孔 中加入400 pL前述三组溶液。然后将P3代人BMSCs用SF．DMEM配制成浓度 为1x105／mL细胞悬液，将100儿此细胞悬液(共lxl04个细胞)加入到Transwell 小室内，置于上述24孔板内。在培养箱中孵育48 h后，通过结晶紫染色观察迁 移至Transwell小室滤膜下层细胞，并统计每视野下(×100)细胞的数量。 4．利用牛尾椎间盘器官培养模型观察RADKPS促进人BMSCs从软骨终板 表面向髓核组织趋化迁移的效果。无菌条件下分离牛尾脊柱功能单位，利用磨 钻去除椎体骨而保留软骨终板。将一侧纤维环纵向切开，用髓核钳摘除少量髓 核组织，再将50皿体积的RADKPS、RADAl6．I及SF．DMEM溶液注入髓核缺 损处，用缝合线将纤维环内外层缝合，置于6孔板中并在培养箱中预先孵育24 h。 将P3代人BMSCs用PKH26荧光染液标记，将标记后的细胞(1x106个)接种 至牛尾椎间盘软骨终板上方。待细胞“贴壁”后，加完全培养液至没过椎间盘，置 于培养箱内培养48 h。经甲醛固定、石蜡包埋后，沿着椎间盘冠状面中央进行 切片，在荧光倒置显微镜下进行观察，计数髓核组织中带红色荧光的细胞数量。 结果：RADKPS及RADAl6．I在体外接触无血清培养液后均能迅速成胶， 同时HE染色观察提示多肽支架结构均一且红染。P3代BMSCs经成骨、成脂、 成软骨诱导后，相应的茜素红、油红O、COLII免疫细胞化学染色均为阳性。体 外迁移实验进行48 h后，RADKPS组迁移至小室滤膜下层的细胞个数为 115．334-11．30，在RADAl6．I组为2