cdc42对小鼠釉质发育影响的初步研究口腔医学专业论文.docx

硕士学位论文本论文分以下四个部分内容： 硕士学位论文 本论文分以下四个部分内容： 第一章：Cdc42在小鼠牙胚发育中的表达 本实验分别获取E13．5、E15．5、E17．5及E19．5的小鼠磨牙牙胚，经过固 定、脱水、透明、包埋蜡块，最后得到组织切片。将组织切片进行HE染色和组 织免疫荧光检测。通过免疫荧光方法检测整个牙胚发育包括蕾状期、帽状期、 钟状期、钟状晚期等过程中Cdc42的表达情况，初步了解其在牙胚发育尤其釉 质发育过程中都有不同程度的表达。 第二章：小鼠成釉细胞离体培养、纯化及鉴定 本实验通过酶消化法体外培养小鼠成釉细胞，缩短培养时间。以基底膜抽 提物包被，利于细胞贴壁及生长。并通过差速消化法，可获得纯化的成釉细 胞。其纯度较高，有利于相关基础研究的进行，为小鼠成釉细胞的体外培养及 纯化提供了思路。 第三章：Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达 本实验通过RT．PCR从mRNA水平证实了小鼠成釉细胞中Cdc42的存在， 用Westernblot从蛋白水平检测了Cdc42在小鼠成釉细胞中的表达，最后通过免 疫荧光进一步明确定位Cdc42主要表达于小鼠成釉细胞胞膜与胞质位置，为以 后探讨Cdc42在小鼠成釉细胞中所发挥生物学功能影响奠定了基础。 第四章：抑制Cdc42对小鼠成釉细胞釉基质蛋白表达的影响 本实验通过运用Cdc42抑制剂MLl41培养小鼠成釉细胞，达到抑制细胞中 Cdc42。再通过Western blot检测小鼠成釉细胞中釉基质蛋白表达水平，从而初 步探寻Cdc42对釉质发育过程可能发挥的作用。 材料与方法 小鼠牙胚切片的制作 分别获取E13。5、E15．5、E17．5及E19．5组织标本。将标本置于4％多聚甲 醛溶液中固定后，再通过50％、70％、80％、90％、95％I、95％II、100％ Ⅲ 万方数据 摘要 摘要 I、100％II的乙醇溶液中按由低到高梯度浓度达到脱水目的。脱水完成的标本 放入二甲苯中透明，再置于60℃的蜡中浸蜡。浸蜡后的组织按照切片需要方 向包埋出蜡块。石蜡切片机上5“m连续切片，捞片放入烤箱备用。 HE染色 将组织切片浸入二甲苯中脱蜡，之后依次经过由低到高梯度浓度乙醇溶液 复水。苏木精染核，盐酸酒精溶液分化脱色，流水返蓝，镜下观察至合适深度 后浸入伊红溶液中染色。复染好的组织切片再次经过脱水透明步骤，最后树胶 封片，正置显微镜下观察。 组织免疫荧光 将组织切片浸入二甲苯中脱蜡，之后依次经过梯度浓度乙醇溶液复水。蒸 馏水洗涤之后，运用枸橼酸钠溶液进行抗原热修复。再通过BSA封闭液封闭非 特异性抗原。一抗4℃孵育过夜，二抗及Hoechst避光室温孵育后，荧光防淬 灭甘油封片，荧光显微镜下观察。 小鼠成釉细胞离体培养 取新生小鼠脱颈处死浸泡于75％酒精中消毒后，沿上下颌骨中线将头部分 为上下两部分，置于预冷无菌的D．Hanks溶液中清洗，于体视显微镜下完整分 离上下颌中的第一磨牙牙胚。将牙胚收集加入0．25％含有EDTA的胰酶中，剪 碎并37℃消化20 rain，每5 rain钟摇晃一次以促进胰酶作用均匀。将所得细胞 悬液1000drain离心5 rain，弃去上清，用含有10％胎牛血清的DMEM培养基 重悬，接种于用0．25 mg／mL Geltrex Matrix包被的培养皿中，置于37℃、 50％C02饱和度和饱和湿度标准条件的孵箱中，隔天换液。 小鼠成釉细胞纯化 利用上皮与间充质两种细胞对胰蛋白酶耐受力的不同，取原代培养4 d细 胞，吸出培养基，用无菌的D．Hanks溶液清洗细胞后，加入0．25％胰蛋白酶， 在倒置显微镜下观察至长梭形成纤维样细胞边缘收缩，而上皮样细胞并无明显 IV 万方数据 硕士学位论文变化，此时加入培养基中止消化，并轻轻淋洗贴壁细胞，然后加入全培继续培 硕士学位论文 变化，此时加入培养基中止消化，并轻轻淋洗贴壁细胞，然后加入全培继续培 养。一周后重复差别消化，连续培养。 细胞免疫荧光 将细胞消化后并种植于细胞爬片上，培养1 d后，用无菌的D．Hanks溶液清 洗，4％多聚甲醛溶液室温下固定10 rain，PBS溶液清洗3次，每次5 rain， 0．1％TritonX-100孵育5 mill后PBS清洗，5％的BSA室温封闭1h，一抗(K14 和砧怔LX)孵育4℃过夜，PBS洗3次，每次5 rain，红色荧光二抗室温孵育 1 h，Hochest复染细胞核，最后用荧光防淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。 RT-PC：R 提取细胞总RNA，将RNA逆转录为eDNA后，用PCR扩增仪进行扩增， 并通过琼脂糖凝胶电泳跑胶，放入激光成像系统中观察。 Western blot 常规提取细胞的蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白的浓度，并