副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素对细胞和仔猪致病作用研究预防兽医学专业论文.docxVIP

分类号 分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素对细胞和仔猪 致病作用研究 The pathogenicity of cytolethal distending toxin of Haemophilus parasuis on cells and piglets 研究生：刘佳 学 号：2012302110143 指导教师：蔡旭旺副教授 指导小组：蔡旭旺副教授 徐晓娟副教授 王湘如讲师 专业：预防兽医学 研究方向：动物传染病 获得学位名称：农学硕士 获得学位时间：2015年6月 华中农业大学动物医学院 二。一五年六月 万方数据 本研究得到国家重点基础研究发展计划(973计划) 本研究得到国家重点基础研究发展 计划(973计划) (No．2012CB5 1 8800)资助 万方数据 华中农业大学学位论文独创性声明及使用捋权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用捋权书 学位论文 是否保密 召 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：支U 佳 时间： 加I多年 6月 I多日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时 本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：保密学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用于本授权书． 学位论文作者签名：支4位 导师签名：蕴赤多D 签名日期：p哆年6月f5日 签名日期：训·箩年6月∥，日 万方数据 副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素对细胞和仔猪致病作用研究目录 副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素对细胞和仔猪致病作用研究 目录 摘要 一i Abstract ．．．．．． ．．．． ． ．．．． ．．．．．． ．． ．． ．ii 缩略词表(Abbreviation) iv l文献综述 。l 1．1副猪嗜血杆菌研究进展 1 1．1．1副猪嗜血杆菌病概述 ．1 1．1．2副猪嗜血杆菌致病机制 ．2 1．1．3副猪嗜血杆菌病防控 ．4 1．2细胞致死膨胀毒素研究进展 6 1．2．1 CDT的结构和各亚基功能 ．7 1．2．2 CDT对细胞的毒性作用 ．7 1．2-3 CDT对动物的致病作用 11 1．2．4副猪嗜血杆菌中CDT小结 ．13 2目的与意义 14 3材料与方法 15 3．1实验材料 ．15 3．1．1菌株、载体、细胞和实验动物 15 3．1．2试剂和试剂盒 ．1 5 3．1．3培养基及抗生素的配制 15 3．1．4主要溶液的配制 16 3．1．5主要仪器 17 3．1．6引物 一18 3．2试验方法 。1 8 3．2．1 pKl8一cdtlUGD和pKl8一cdt2UKD自杀性质粒的构建 。18 3．2．2 cdt基因缺失株的构建 25 3．2．3 cdt基因缺失株的鉴定 ．．25 3．2．4生长曲线的绘制 28 3．2．5 CDT对PK-15细胞的毒性试验(细胞形态观察) 28 3．2．6 CDT对PK-15细胞的毒性试验(LDH活性测定) 。29 3．2．7 CDT对3D4／2细胞的抗吞噬作用 30 3．2．8 CDT对仔猪的致病作用 30 4结果与分析 ．3 1 万方数据 华中农业大学2015届硕士研宄生学位论文4．1 华中农业大学2015届硕士研宄生学位论文 4．1 pKl8-cdtlUGD和pKl8-cdt2UKD自杀性质粒的构建 31 4．2 cdt基因缺失株的构建 ．33 4．3 cdt基因缺失株的鉴定 ．33 4．3．1 PCR鉴定缺失株 33 4．3．2 Southern blot鉴定缺失株 一35 4．3．3 DNA测序鉴定缺失株 36 4．4生长曲线的绘制 一37 4．5 CDT对PK一15细胞的毒性试验 ．37 4．5．1细胞毒性之细胞形态的观察 ．37 4．5．2细胞毒性之LDH活性的检测 41 4．6 CDT对3D4／2细胞的抗吞噬作用 一41 4．7 CDT对仔猪的致病作用