基因的重组与转移.pdf

第五章 基因的重组与转移 第五章 基因的重组与转移 外源DNA 载体DNA 连接 重组分子 转化或转导 电穿孔或显微注射 原核细胞 受体细胞 真核细胞 扩增或表达 表达 第一节 DNA片段的体外连接 第一节 DNA片段的体外连接 第二节 重组体导入细菌细胞 第二节 重组体导入细菌细胞 第三节 外源基因导入真核细胞 第一节 DNA片段的体外连接 一、粘性末端的连接 DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与 3’-OH连到一起。 1. 两段DNA 的连接 依靠粘性末端 2. DNA片断与载体的连接 依靠粘性末端 ligase nick 二、齐平末端（blunt end ）的连接 1. 直接连接 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易 被连接酶连接。 T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但 效率很低，只有粘性末端的1%。 5’ 5’ P- -OH 3’ P- -OH 3’ 3’ HO- -P 5’ 3’ HO- -P 5’ 5’ P- -OH 3’ 3’ HO- -P 5’ 2. 人工加尾形成“粘性末端” （1）同聚加尾法 1972年，斯坦福大学的P. Labban 和P. Kaiser提出。 ①原理： DNA末端转移酶能在没有模板的情况下 给DNA 的3’-OH端加上脱氧核苷酸。 ②加尾—碱基互补 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸 ③优点： 能把任何 片段连接 起来 ④缺点： 不能把插 入片段再 切下来 非酶切位点 （2 ）衔接物(linker)连接 ①linker 用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限 制性内切酶识别位点序列的平端双链。 EcoRI linker ： GGAATTCC CCTTAAGG ②linker 的作用 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然 后再用酶切，形成一个人工粘性末端。 ③优点： 1）可以用内切酶把插入片段切下来。 2 ）能给载体连接上Polylinker: ④缺点： 如果插入片段内部也有该酶位点，不能 切下完整的插入片段 （3 ）DNA接头(adapter) 连接法 （3 ） 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。 ①adapter 一头平末端、另一头粘性末端（某种酶 切位点序列）。 5’p-GATCCCGG-OH3’ BamHI adapter GGCC-p5’ ②adapter的作用 用T4