对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白基因克隆表达及表达产物抗病效果的研究特种经济动物饲养专业论文.docxVIP

濑江夫学孽考攀往论丈：中文稿要摘 濑江夫学孽考攀往论丈：中文稿要 摘 要 本研究以中国对虫下为材料，从瘸虾组织中分离出白斑综合征病毒(white spot synome virus，简称WSSV)野生毒株(暂时命名为浙江株，WSSV．ZJ)，以该 病毒基因缌为模板，采翅PCR技术扩壤了wsSv戊J的囊膜蛋囊VP28帮VPl9 的基因，势捌采用大豚稃菌和抒袄瘸潮}琵虫表i鑫系统迸手亍了遗两个基嚣的袋达 研究，并初步试验了蚕蛹表达产物在凝虾抗对虾自斑综合征(wsS)的效果。主 要研究结果如下： 1。2001年5胃获潦汪耋蒙出鍪菜慰菸葵建耱袋集意叁爨瘸豹孛雪怼羚，弱 WSSV的实验模式动物克氏原螯虾(Cambarus proclarMi)作了动物回归试黢， 试验虾在3～10天内几乎全部死亡；用蔗糖密度梯度法纯化的瘸毒在电镜下的大 小、形态特征与wsSV极巍相议(完整鲍病毒靛学丈小约100×400nm，菝袭壳 大，j、约60×350nm)；戳该病毒基霞缀DNA为模叛，应用PCR技术，扩增懑了 WSSV的特异性条带，从而从病毒的致病性、形态特征和特异性DNA片段镣方 面证实了分离获得的瘸灏是对虾白斑综台征病毒。 2。糕耀PCR技拳，扩增获褥了痰霉麴嚣令囊貘蛋白基爨，蒸毽J睾罗l全妖分 别为615却和366bp，编码的氨基酸残基数分别为204和121，它们与GenBank 中登录的WSSV囊膜蛋白VP28和VPl9基因的同源性均在99％以上，而与戴它 病毒DNA片段的同源燃则很低。 3。将梵疆鹫静W28、vpl9基瓣逶过适当豹懿切后插入至g袋运载俸pET30a 的多克隆能点中，获得煎组质粒蜮T30a-毕28和pET30a-vpl9。将它们替八 Ecoli．BL21中，在37℃下，经IPTG诱导表达4小时后．用SDS．PAGE和Western blotting邀露捡溺，发蠛啦8基因静袭达产甥均鼗l瑗了臻显懿特器淫条豢，箕融 合表达产物的大小与獭测的一致，而在W19基因均宋见表达产物的特异性祭带。 4．为了获得与天然VP28、VPl9结构与活性较一致的表达产物，本研究采用 了表达产物居加工较完麟豹杼状病毒一家蚕表达系统。将克隧刘的峭8、vpl9 基霞逶遭逶鋈蠢孽酶诱嚣播入莼转移鬟粒pBlueBaeI-IisC静多竞藩茬蠢孛，获褥霪 组质粒pBlueBaeHisC-w28和pBlueBacHisC．vpl9。将重组质粒分别与新型杂交 病毒HyNPV(具有B酬娜．v和AcNPV双重优点)按转染Sf9细胞(秋粘虫煳胞 攮，逶过羧自褒舞选分裂获褥’了耋缀痣毒HyNPV-vp28羁HyNPV—vp]9(潦发 分别为：O．69x 107。7和0．69X 107‘)。将这两种重缀病毒分别感染SD鲴臆，三 天后细胞均发生了严重的病变；将它们分别穿刺攘种家蚕五龄起蚕，3～4哭后 家蚕出现了明显的发病攘状(蚕体俸蹙半透明，环节肿胀等)。接种后4·5必， 取病蚕戆鑫辩巴迸霄SDS黎Western blot稔溺，均窭瑷彳瑟显嚣特舅浚条 带。融合畿达产物的分予量比根据核背酸序列预测的分别要大4KD左右．萄天 2 渐江大学博番拳位论文：中文撬要然的VP28、VPl9分子墩较一致，证明在该表达系统中表达产物得到了较完警的 渐江大学博番拳位论文：中文撬要 然的VP28、VPl9分子墩较一致，证明在该表达系统中表达产物得到了较完警的 嚣热工。 5。将含霪组WSSV瓣膜蛋自的蚕蛹加入饵料，用克氏原螯虾(WSSV的实验 模式动物)进行了抗WSS的初步试验。以0％、1％、5％和20％的比例在基础饵 料中分别添加含重组蛋嬲VP28、VPl9和VP28+VPl9的蚕蛹。结果显示：(1) 在试验鬟麓豹15天孛，试验耄平均强亡率为18。5％，其中缮14(含20％VP28 +VPl9的薰蛹)死亡帛高达50％，而作为对照的组1(不加蚕蛹)为3．3％，组 2、3、4(加1％、5％、20％无病毒感染蚕蛹)平均为6．7％，组5、6、7(加1％、 5％、20％HyNPV病毒感染敕蚕蛭)平均尧7．8％，缀14死亡察院三令对照缀分 别离46．7％(PO．01)、43-3％(P《O．01)和42．2％(PO．01)，其它试验缀与 对照均无鼹著差异(P0．05)；(2)在试验第16—30天期间，试验组平均死亡 率为3．5％，三个对照平均死亡率为3．3％，二者光明显差异(PO。05)；(3)在 试验豹雾3l、32天攻辫二天≤塌壤禽WSSV豹爨虾亵)，予翳34天瑟始麓瘸， 在第37—40天期间出现死亡高峰，谯第45天试骏结束时，试验组平均死亡帮为 7．7％，三个对照平均为97，1％，前者比后者低89．4％(P0．01)。 关键词：对妻下 自鬓综合征病毒 囊膜蛋自蒸函 克陵 表达 豁虾 抗病试验 3 撒扭太擎搏士