spag6l基因真核表达质粒在细胞内的蛋白表达与定位及启动子转录调节活性研究公共卫生与预防医学专业论文.docxVIP

武汉科技大学 武汉科技大学 研究生学位论文创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进 行研究所取得的成果。除了文中已经注明引用的内容或属合作研究共 同完成的工作外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论j叫乍者签名： Z丝兰 日期：!!!!：!：兰￡ 研究生学位论文版权使用授权声明 本论文的研究成果归武汉科技大学所有，其研究内容不得以其它 单位的名义发表。本人完全了解武汉科技大学有关保留、使用学位论 文的规定，同意学校保留并向有关部门(按照《武汉科技大学关于研究 生学位论文收录工作的规定》执行)送交论文的复印件和电子版本，允 许论文被查阅和借阅，同意学校将本论文的全部或部分内容编入学校 认可的国家相关数据库进行检索和对外服务。 黼撇：坐丝 指导敦燃：亟!垒塾 日 期： 万方数据 摘要目的：构建小鼠Spa96三基因的真核表达质粒，并研究其在哺乳动物细胞内的表达与 摘要 目的：构建小鼠Spa96三基因的真核表达质粒，并研究其在哺乳动物细胞内的表达与 定位。构建上游启动子荧光素酶报告基因重组质粒，并检测其转录活性。 方弦：以小鼠的睾丸cDNA基因文库作为模版，PCR扩增印昭配基因全长序列，测 序正确后亚克隆至pEGFP．N2和pcDNA3真核表达载体中并酶切鉴定。将构建成功 的重组表达质粒转染至COS一7与CHO细胞中，Western．blot法检测COS．7细胞中 Spa96L蛋13表达，激光共聚焦扫描显微镜观察Spa96L蛋白在CHO细胞内的定位。 构建上游启动子荧光素酶报告基因重组质粒Spa96L／PGL3，用双荧光素酶法检测其 转录活性并与Spa96进行比较。 结果：重组质粒Spa96L／pEGFP和Spa96L／pcDNA3经双酶切后产生的1．5kb的目的 插入片段，经测序证实与Spa96L基因一致。GFP．Spa96L融合蛋白分子量为82kD， Spa96L蛋白分子质量为56kD。Spa96L蛋白在CHO细胞中主要定位于细胞质，以微 管和囊泡表达为主。 Spa96L上游启动子转录调节序列荧光素酶活性明显强于Spa96。 结论：构建Spa96L／pEGFP、Spa96L／pcDNA3和Spa96L／PGL3重组质粒成功，为进 一步探究Spa96L基因与Spa96基因的关系以及Spa96L基因在精子发生中的作用奠 定了基础。 关键I词：SpagOL基因；精子发生：转录调节；蛋白表达；细胞定位。 万方数据 AbstractObjective：To Abstract Objective：To construct eukaryotic plasmids expressing mouse SpagaL gene，and investigate its expression and localization in transfected mammalian cells．1uciferase reporter recombinant plasmid on promoter are was constructed，and its transcriptional activity was detected． Method：The mouse Spa96L coding sequence was amplified by ploymerase chain reaction (PCR)and subcloned into the pEGFP-N2 and pcDNA3 vectors，respectively．After sequencing，the constructed plasmids were transfected into CHO and COS．7 cells，the expression and cellular localization of Spa96L protein were determined by Western blot analysis and immunofluorescence staining．Luciferase reporter recombinant plasmid Spa96L／PGL3 on upstream promoter area was constructed，following with detecting its transcriptional activity． Result：Mouse Spa96L was successfully cloned into the pEGFP-N2，pcDNA3