双退火温度PCR扩增DNA.pdf

微生物学报 A cta Microbiologica Sinica 2017, 57(8): 1262-1269 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Article 研究报告 双退火温度 PCR 扩增 DNA 1 1 1 1 1 1,2* 黄亚威 ，杨昂 ，上官云杰 ，贺添艳 ，徐文选 ，刘亮伟 1 河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002 2 农业部农业酶工程重点实验室，河南 郑州 450002 摘要：【目的】与设置单一退火温度的常规 PCR (S-T PCR)不同，本研究探讨双退火温度 PCR (D-T PCR) m m 由高到低设置 2 条引物各自退火温度。【方法】以PxF61 和 VPel 为正/反向引物，用 Q5 DNA 聚合酶扩 增 4.3 kb 的模式 DNA pET20b-Xyn (黑曲霉木聚糖酶基因) 。PCR 程序为：98 °C 预变性 3 min ，30 次循 环 {98 °C 变性 30 s ，设置双退火[Tm1 70 °C (PxF61)退火 15 s、Tm2 62 °C (VPel)退火 15 s]，72 °C 延伸 130 s}。【结果】与S-T PCR (61 °C)相比，D-T PCR 扩增 4.3 kb 的目的条带亮度更高，减少 2 条杂带； m m 经 25 次循环目的 DNA 产物量最高。D-Tm PCR 用于长片段引物扩增 5.3 kb 重组质粒 DNA 条带更明显。 【结论】D-Tm PCR 直接扩增目的条带，避免了探讨 Tm 的麻烦，不要求 2 条引物 Tm 相近，从理论上更 加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程。 关键词：双退火温度，PCR ，DNA PCR 是重要的分子生物学操作技术[1] ，广泛 关键因素[18–19] 。引物 Tm 值根据引物与模板匹配序 用于基因扩增、诊断[2–4] 、酶工程等领域[5–6] 。科学 列长度、碱基种类和 GC%含量，通过理论公式、 研究中开发了不同 PCR 扩增方式：如多重 PCR ， 经验公式、软件、网上平台等方法计算，以低于 逆转录 PCR ，非对称 PCR 、重叠延伸 PCR[7–8] 、反 理论 Tm 值的温度设置为 PCR 退火温度。常规 PCR 向 PCR[9] 、荧光定量 PCR[10–11] 、连接 PCR[12] 、解 选择两条引物中较低 Tm 值作为退火温度，称为单 旋 酶 PCR[13] 等 ， PCR 还 用 于 无 限 制 性 酶 切 一退火温度 PCR (S-T PCR) 。S-T PCR 要求 2 条 m m (restriction enzyme free)的重组质粒构建[14–15] 。目 引物 Tm 值接近(ΔTm ≤5 °C) ，但是 Tm 值涉及引物 的基因特异性和扩增量受模板量、引物量、dNTPs 匹配区域 DNA 序列、引物 GC%含量、碱基数目、 与 Mg2+浓度等参数影响[16–17] 。 种类等多种因素。要用温度梯度 PCR 、降落 PCR 设置合适的退火温度(Tm)是 PCR 操作成功的 (TD ：Touchdown PCR)探讨合适 Tm[20] ，有时经过 基金项目：国家自然科学基金 *通信作者。Tel ：+86-371；Fax ：+86-317；E-mail ：liangwei@