多发性骨髓瘤致病相关基因的克隆及功能初步研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

博七学泣论文 博七学泣论文 中文摘要 多发性骨髓瘤致病相关基因的 克隆及功能初步分析 中文摘要 一、定位候选克隆策略(positional candidate cloning)是传统 定位克隆(positional cloning)的改进和发展，且在克隆疾病相关基 因中发挥重要的作用。人类基因组计划的迅猛发展，基因组精细遗传 图谱和物理图谱的完成使精细定位多基因疾病的相关基因成为可能。 多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一严重危害中、老年人健康 的血液系统恶性肿瘤。西方发达国家Ⅻ发病率为4／10万，占血液系 统恶性肿瘤患者的10％，居血液系统肿瘤致死率的第二位。而在我国 MM发病率为1／10万，患病人数相当之多，且随着我国人口的老龄化， MM发病率仍有上升趋势，因此MM的发病机理、诊断、治疗的研究正 越来越受到人们的关注与重视。文献资料表明心患者大多数存在染 色体13q14．2～13q14．3及13q21．1的缺失。通过计算机查询获取疾 病基因定位区域内代表新基因ESTs序列，运用半定量RT-PCR检测它 们在正常骨髓组织与多发性骨髓瘤患者骨髓组织中的表达水平，发现 一条在多发性骨髓瘤患者组织中明显表达下调的EST(GenBank收录 号：H86826)，MTN膜杂交分析其转录本大小为1．5Kb+。通过购买商 品化的IMAGE 223589克隆进行序列分析获得全长eDNA序列，长度为 149lbp。人类基因组命名委员会将其命名为MYETSl(multiple myeloma tumor suppressor 1)。生物信息学分析其为一个编码分子 量为15107．9道尔顿，等电点为6．13的134个氨基酸的新基因。该基 因的功能正在进一步的研究之中。 多发性骨髓瘤抑瘤候选基因的克隆将为研究多发性骨髓瘤发病 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 机理及早期诊断、治疗多发性骨髓瘤提供新的分子靶。 二、根据CenLank收录的多发性骨髓瘤细胞株(ARH一77)表达上调 EST AF497797设计引物，采用半定量RT—PCR证实了多发性骨髓瘤患 者及正常人骨髓细胞该EST的表达差异。用该EST作探针进行 Northern印迹分析以及筛选人胚肾cDNA文库，获得克隆经测序并用 生物信息学方法初步分析了该cDNA序列。Northern印迹分析结合 cDNA文库筛选获得的全长eDNA克隆序列长1 248bp(GenBank登录 号：AY094612)。生物信息学分析显示该片段全长eDNA编码一个长度 为44个氨基酸的多肽，且可能属于Alu超基因家族成员。进一步运 用多组织表达膜(multiple tissues expression，MTE)杂交、RNA点 杂交、半定量RT—PCR方法分析该cDNA序列在多种不同肿瘤组织与正 常组织中的表达。多组织表达膜杂交结果显示AY094612在膜上各种 正常组织以及几种癌细胞系中均有表达。RNA点杂交及半定量RT-PCR 均显示AY094612在直肠癌、肺癌、脑瘤组织中均表达水平上调，其 它如胃癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌患者的组织中亦有部分表达水 平上调。 AY094612为一个在多发性骨髓瘤中表达上调的Alu超基因家族 成员且可能参与多发性骨髓瘤的发生与发展。AY094612在多种正常 组织中广泛表达，在部分实体瘤组织中表达上调提示其可能是恶性肿 瘤发生的一个重要因素。 三、根据GenBank收录的多发性骨髓瘤细胞株(ARH一77)表达上调 EST AF425300设计引物，运用半定量RT—PCR检测多发性骨髓瘤患者 及正常人骨髓细胞中该EST的表达水平。运用MTN膜进行Northern 杂交分析该EST在多种组织中的表达。进一步利用该EST作探针，筛 选人胚肾cDNA文库结合“电子杂交”购买商品化的IMAGE克隆测序， 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 获得全长cDNA克隆，对该序列进行了分析。结果显示，该EST在多发 性骨髓瘤患者骨髓细胞中亦有较高的表达，而在正常人骨髓细胞中低 表达。经测序证实，该cDNA全长为452bp(GenBank收录号： AF487338)。预测其编码一个57个氨基酸的小分子量蛋自质，属于与 DNA复制有关的解旋酶／引物酶基因家族的新成员，定位于染色体 2q37，3区。人类基因组命名委员会将其命名为MYEOV2(myeloma overexpressed gene 2)。将该基因RYEOV2克隆到荧光表达载体 pEGFP—C2，转染COS7细胞，48