血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定.docVIP

. .. 血清清蛋白、γ-球蛋白分离、纯化与纯度鉴定 一、实验目的 1.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 2. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 5.学习柱层析技术 二、实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 （一）粗提原理-盐析法 1.盐析法：在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度， 或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。 2.水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。 3.蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。 4.由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 （二）脱盐原理-凝胶层析 1.盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。 2.凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 （三）纯化原理-离子交换层析 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 （四）纯度鉴定-醋酸纤维素薄膜电泳 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法： （一）实验材料 1.样品：人混合血清 2.试剂：葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱、各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液、pH8.6巴比妥缓冲溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水杨酸溶液、饱和硫酸铵溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液 器材：层析柱、电泳仪、电泳槽、离心机、离心管、黑色反应板等 （二）实验方法 取血清1.0ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min1.实验步骤 取血清1.0ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min 盐析 盐 析 沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解 沉淀（含球蛋白） 加水 0.6ml溶解 上清液（含清蛋白、少量α 球蛋白和β球蛋白） 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm）过葡聚糖凝胶G-25 过葡聚糖凝胶G-25 层析柱（1.0×7cm） 过葡聚糖凝胶G-25 层析柱（1.0×7cm） 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱 用1ml 0.02mol/L NH4 AC缓冲液清洗层析柱 内壁,流出液量约1ml 用1ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,流出液量约1ml 凝胶柱层析除盐 凝胶柱层析除盐 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱 继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液(2ml)洗脱 磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质 磺基水杨酸 检测蛋白质 磺基水杨酸 检测蛋白质 收集含有蛋白质的峰液15d收集含有蛋白质的峰液15d 收集含有蛋白质的峰液15d 收集含有蛋白质的峰液15d 继续用2ml 0.02mol/L NH 继续用2ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤 继续用0.02mol/L NH4AC缓冲液洗涤约2ml BaCl2检测至SO42-阴性BaCl2检测至SO42-阴性 BaCl2检测 至SO42-阴性 BaCl2检测 至SO42-阴性 用2~3ml 用2~3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡 用2~3ml 0.02mol/L NH4AC缓冲液再生平衡 离子交换柱层析纯化 离子交换柱层析纯化 除盐后收集的球蛋白除盐后收集的清蛋白 除盐后收集的球蛋白 除盐后收集的清蛋白 过DEAE-纤维素层析柱（ 过DEAE-纤维素层析柱 （1.0×6cm） 过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm）