肺癌血清分子标志物的分析及应用病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

中国协和医科大学博士学位论文肺癌血清分子标志物的研究及应用 中国协和医科大学博士学位论文 肺癌血清分子标志物的研究及应用 中文摘要 肺癌是f“重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤，具有发病率高、死亡率 高、五年生存率低的特点。降低肺癌“两率”以及提高患者预后的关键汹题 在于肺癌的甲期发现和早期诊断。然而，目前仍然缺乏有效的技术和手段。 SEREX技术的建立不仅为肿瘤抗原的筛选提供了‘种新途径而17．该方法 通过对肿瘤抗原的自身抗体进行检测为肿瘤的发现提供了一种新型的血 清学标志物。然而，目前对这些肿瘤抗原的自身抗体研究甚少，而且已有 的研究均集中在对IgG型抗体的研究f：，罕有其它类型抗体研究的报道。 为此，本研究采用了改进的SEREX方法对介导IgM体液免疫的肺癌抗原 进行了筛选和鉴定，采用自己建立的抗原蛋白芯片技术对多个抗原的自身 抗体进行了深入的研究，以期攒示这些肺癌抗原的血清抗体谱与肺癌发 牛、发展的内在联系，从而为肺癌以及癌前病变的早期诊断、高危人群的 筛查提供有用的血清学标志物和有效的检测手段。 第一部分肺癌相关抗原的筛选、分离及鉴定 采用多种病理类型的早期肺癌组织构建了肺癌的cDNA表达文库，原 始文库库容达到4×106pfu。使用舍有多种肺癌病理类型的自体以及30例异 体混合血清埘介导lgM体液免疫反应的肺癌抗原进行了筛选。目前，使用 异体混合血清筛选文库的报道较少，而筛选介导IgM免疫反应的肿瘤抗原 还未见报道。结果共获得了78个阳性抗原克隆，核苷酸序列测定和生物信 息学分析表明这78个阳性克隆代表了56个不同的抗原基凼。根掘其生物学 中国协和医科大学博士学位论文 中国协和医科大学博士学位论文 功能¨J‘以分为以卜_5类：1．转录凋节相关基因，例如：hnRNPAl，EEFlAl 等：2．蛋白功能调节相关基凶，例如：CHK及PTP4A等；3．细胞生长及凋 亡相关基因，例如：Mcl一1，TNFAIP3等；4．细胞粘附与迁移相关基凶， 例如：MMP2，FNl等；5．功能未知基因，例如：C70rf20，MGCl0084等。 采用Western blot的方法对这56个抗原克隆在20例肺癌及20例i卜常人Im。寿 中的IgM)及tgG自身抗体进行检测发现，所有56个克隆在至少1例肺癌血清 中均发现了相应的自身抗体。其中有42个克隆在至少l例肺癌患者血清中 检测到了相应的IgM抗体，阳性率在5％一75％之问，币常对照血清的阳性率 在O％．35％之间；有47个克隆在至少l例肺癌患者血清中检测到了相应的 IgG抗体，阳性率从5％．70％，iE常对照妞清的阳性率在O％一35％之阔。因 此，首次证明了肺癌抗原不仅能够介导IgG体液免疫反应而且能够诱导产 生特异性的IgM自身抗体。这些抗原在异体肺癌血清中较高的抗体阳性率 提示，对这些肺癌抗原的血清抗体进行检测可能为肺癌的发现提供有用的 血清学标志物。 第二部分肺癌相关抗原的自身抗体谱研究 采用SMARTA的方法对56个抗原克隆在50例肺癌和50例正常人血清 的自身抗体进行检测发现，37个抗原克隆在至少～种类型(IgG或lgM) 的抗体反应中，肺癌血清的阳性率明显的高于正常人。挑选了其中1 5个肺 癌与正常人抗体反应差异最为明显的肺癌抗原进行了基因的重组构建。在 大肠杆菌中成功表达了这l 5种抗原蛋白，采用Ni．NTA His—Bind Resins和 SDS．PAGEfib0备胶电泳制备了纯度大于90％的蛋白，经过复性后制各了抗 原蛋白芯片。在国内外首次对传统的蛋白芯片方法进行了改进，通过设立 抗原蛋白的点内、点问以及片问对照极大的提高了芯片检测的稳定性和重 复性，从而为血清抗体的检测提供了一种简单、快速、经济、有效而可靠 的定量技术与方法。采用这种改进的蛋白芯片技术对1 5个抗原蛋白存100 中国协和医科大学博士学位论文例肺癌和100例正常人血清中的自身抗体进行检测发现这些抗原的自身抗 中国协和医科大学博士学位论文 例肺癌和100例正常人血清中的自身抗体进行检测发现这些抗原的自身抗 体具有明显的肺癌相关惟。进一步的分析结果表明这些抗原诱导机体产生 的血清自身抗体谱发zE在肺癌的早期并且随着肺癌的发生、发展不断的变 化。说明肺癌的发生是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程，每个阶 段都有其特异性表达的抗原，这蝗时序性表达的抗原通过刺激机体的免疫 系统诱导自身抗体的产生也就形成了一个时序性存在的血清抗体谱。此 外，我们还发现不同病理类型肺癌衄清中存在的抗体谱既有重叠又存在差 异，说明不同类型的肺癌发生具有一定的共性及其特性，因此抗原的表达 既有相同也有着不同的偏向性。这些结果都表明寻找在不同类型以及不同 发展阶段肺癌中存在的特异性抗体谱就可能用于肺癌的，譬期诊断、筛查、 分期以及分型