实验3-细菌的简单染色和革兰氏染色..pptVIP

实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色 细菌的简单染色和革兰氏染色 一 目的要求 二 基本原理 三 实验材料 四 无菌操作过程 五 操作步骤 六 实验报告 七 思考题 一 目的要求 （一）细菌的简单染色原理 （二）革兰氏染色基本原理 （二）革兰氏染色基本原理 三 实验材料 四 无菌操作过程 （一） 简单染色操作步骤 （二）革兰氏染色操作步骤 六 实验报告 七 思考题 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 G+菌细胞壁化学组成以肽聚糖(peptidoglycan)为主。这是原核微生物所特有的成份，占细胞壁物质总量的40-90%。 G-有肽聚糖，仅占细胞壁干重的5-10%。肽聚糖结构与G+相同，但短肽尾中的３号位上L-Lys往往被其他二氨酸取代 G-细胞壁的组成和结构比G+更复杂。主要成份为：脂多糖、磷脂、脂蛋白、肽聚糖。 革兰氏阳性细菌的细胞壁特点：厚度大（20~80nm） 化学组分简单，一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。 埋藏在外膜层之内，是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm)，含量约占细胞壁总重的10%，故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。 厚约20~80nm，由40层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。 脂多糖的主要功能壁磷壁酸，它与肽聚糖分子间进行共价结合，含量会随培养基成分而改变，一般占细胞壁重量的10%，有时可接近50%。用稀酸或稀碱可以提取 跨越肽聚糖层 并与细胞膜相交联的膜磷壁酸（又称脂磷壁酸），由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用45%热酚水提取，也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。 * * 细胞的结构 一般结构：一般细菌都有的构造 特殊结构：部分细菌具有的或 一般细菌在特殊环境下才有的 革兰氏染色 C.Gram（革兰）于1884 年发明的一种鉴别不同类 型细菌的染色方法。 ◆用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染 ◆用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。 ◆用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。 ◆用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色 1 学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理，理解着色机理。 学习并掌握无菌操作的技术。 3 掌握简单染色\革兰氏染色的方法，并能正确染色 4 巩固显微镜油镜的使用方法。 二 基本原理 细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察，所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。 简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式. 染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均应维持细胞原有形态。 （一）细菌的简单染色原理 革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是根据革兰