单分子PCR产物错误率分析-LibraryInstituteofBiophysics.PDF

2004;31(2) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 159 单分子PCR产物错误率分析* 王国华，)吕军鸿，)雷晓玲，)李海阔2)李民乾)‘陈润生，)方海平，)胡 钧’,2),. (’〕中国科学院上海应用物理研究所，上海201800:z)上海交通大学Biu-X生命科学研究中心，上海200030 ”中国科学院生物物理研究所，北京1娜101) 摘要 碱基错配致使PCR扩增产物中存在突变序列.大量模板PCR扩增时突变序列所占的比例较低，对随后进 行的PCR产物分析影响不大，但当对微量甚至单个模板DNA扩增时，情况则完全不同.对单分子PCR产物的 错误率进行了理论分析，结果表明:根据实验目的和条件，选择忠实性不同的聚合酶是十分关键的. 关键词 单分子PCR，错误率，忠实性，模板数 学科分类号 0503 体外DNA扩增时，聚合酶可能引发的碱基错 T二0x(1+k) (1) 配使聚合酶链式反应 (polymerasechainreaction, 其中T为产物片段数，0为初始模板数，k为扩增 PCR)的产物出现错误，因此正确地计算出产物的 效率，N为扩增循环数.在常规PCR实验中，大 错误率成为一个重要的问题.在常规的分子生物学 量初始模板数下，一次扩增循环后正确链的概率遵 实验中，模板数通常很大 (一般为105个以上)， 循泊松分布的未击中事件的概率，则进行N次循 如果使用忠实性低的耐热Taq酶 (掺人错误率为 环后产物错误率F即为 10-1/帅)，在扩增效率为70%时，将200by长的 F二1一。Lxf.N (2) 片段扩增一百万倍，产物错误率为33%，而使用 其中L为片段长度，f为聚合酶的掺人错误率. 忠实性高的pfu聚合酶 (掺人错误率为7x 虽然扩增过程不变，但是在小样本情况下，泊 10一今bp)，同样实验效率下将500帅长的片段扩 松分布不再适用，公式 (2)不能直接用于计算单 增一百万倍，产物错误率仅为。.7%川.可见，大 分子PCR产物的错误率.所以在我们的计算中， 量模板下的PCR产物中突变序列通常只占其中一 当扩增产物到达10，以前用随机数进行模拟，也就 小部分，大多数情况下不足以影响随后进行的实验 是说利用计算机产生足够多的随机数，通过判断产 分析z一〔〕. 生的随机数是否大于所使用的聚合酶掺人错误率来 最近，基因组测序和法医诊断学的需求，极大 决定一个碱基是否发生了突变，从而计算某一循环 地促进了以少量甚至单个DNA分子为模板的单分 的产物错误率.当产物的量达到105以后则可继续 子PCR扩增 (singlemoleculePCRamplification)实 采用公式 (2)，以简化计算过程.这里选择105作 验的发展1，一“〕.在这类实验中，模板数很少，聚 为计算转折点，是因为常规实验下以105为扩增起 合酶导致的突变一旦发生，在随后的循环中都会随 点，我们希望两种情况下的计算能够尽量接近.扩 着原来的序列一起呈指数扩增，并且由于还可能产 增循环次数N仍然遵循公式1的规律 (这里不考 生新的突变，使得突变序列随扩增循环数的增加而 虑没有扩增产物的前两个循环). 不断加大其所占比例，从而可能严重影响最终的实 实验使用的软件是Matlab6.0,假设扩增效率 验结果.因此，事先对单分子PCR扩增产物的错 均为70%.我们选用了两种典型的聚合酶，忠实 误率进行论证分析是十分必要的，并且也已引起人 性低而常用的耐热Taq酶 (掺人错误率为2x 们越来越多的重视. 10-0/bpll)和忠实性最高的pfu酶 (掺人错 1研究方法与实验环境