不同固定方法对细胞骨架荧光染色的影响.DOC

不同固定液对细胞骨架荧光染色标记效果的影响 罗 果，保玉心，李 晋 （563003 贵州 遵义，遵义医学院中心实验室） [摘要] 目的 比较不同固定液对细胞骨架荧光染色的差异，选择最佳固定方法。方法 分别采用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛/MES 4种固定液，对人肺腺癌细胞H1299进行固定，对其微管和微丝荧光标记后，在共聚焦显微镜下观察其形态结构。结果 4%多聚甲醛/MES对细胞的微管和微丝都有很好的固定作用。4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇对细胞的微丝基本能起到固定作用，而4%甲醛对微管的固定效果略差，2%戊二醛、95%乙醇固定的细胞看不到微管的具体形态结构。结论 细胞骨架的固定中需加入骨架稳定剂，且根据实验目的，选择适当的固定液获得最佳标记效果。 [关键词] 细胞骨架；激光共聚焦显微镜；H1299细胞；荧光染色 [中图法分类号] [文献标志码] B 激光共聚焦显微镜是研究细胞骨架的最佳仪器[1]。从形态观察、定位、定量到分子结构与功能调节以及病理变化等各方面对细胞骨架进行研究，成为现代生物医学中重要课题[2-4]。共聚焦样本的制备包括样本的预处理和荧光标记2个主要步骤，样本制备的好坏直接决定实验的成功与否。MES是一种具有较高去污力的表面活性剂，生物溶解性能好，工业上常用于液体洗涤中作活性物、分散剂等，在细胞生物领域中常用作某些组织结构的稳定剂，本实验中采用4种常用细胞固定液，同时结合2-(N-吗啉基)乙磺酸（MES），分别固定人肺腺癌细胞H1299，并对其微管和微丝进行荧光标记，通过激光共聚焦图像的观察和分析，探讨不同固定液对细胞骨架的影响，选择最佳固定方法。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂和仪器 人肺腺癌细胞系H1299：由我校生化教研室范芳副教授惠赠。DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青生物公司)，Phalloidin-TRITC(Sigma公司)，鼠抗人β-tubulin (USBiological公司)，羊抗鼠IgG-FITC(Santa Cruz公司)，多聚甲醛(Sigma公司)，MES(Solarbio公司)，Triton X-100(Solarbio公司)。激光共聚焦显微镜(Leica SP2)，二氧化碳培养箱(Thermo公司), 超净工作台(苏州净化)。 1.2 H1299细胞培养 复苏液氮冻存的H1299细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，接种于细胞培养瓶中，置37 ℃、5%CO2 培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用胰酶消化成单个，调整细胞浓度为2?104/ml，接种于Petri皿中，培养12 h 1.3 H1299细胞的固定 取出Petri皿，分别用4%甲醛、2%戊二醛、95%乙醇和4%多聚甲醛/MES对Petri皿中的细胞进行固定，具体方法[5-9]如下：① 4%甲醛固定：Petri皿中的细胞用PBS冲洗3次，用4 ℃预冷的4%甲醛室温固定20 min;② 2%戊二醛固定：Petri皿中的细胞用PBS冲洗3次, 用2%戊二醛室温固定15 min，再用1g/L的NaBH4洗3次，每次4 min;③ 95%乙醇固定：Petri皿中的细胞用PBS冲洗3次，用95%乙醇室温固定30 min；④ 4%多聚甲醛/MES固定：Petri皿中的细胞用37 ℃预热的MES(MES 90 mmol/L, MgCl2 2 mmol/L, EDTA 1.5 mmol/L, PEG8000 5 mmol/L)冲洗3次，用4%多聚甲醛/MES室温固定20min， 1.4 间接免疫荧光法标记细胞微管 将固定好的细胞用0.5% Triton/PBS洗涤3次、每次10 min，加入鼠抗人β-tubulin，37 ℃孵育1 h，再用0.5% Triton/PBS洗涤3次、每次10min，加入羊抗鼠IgG-FITC，37 ℃孵育1 h，用0.5% Triton/PBS洗涤3次、每次10 1.5 直接标记法标记细胞微丝 向标记好微管的细胞中直接加入Phalloidin -TRITC，室温孵育15 min，再用PBS洗3次，每次10 min。最后向Petri皿中滴加90%甘油/PBS，激光共聚焦显微镜扫描成像，物镜用63倍油镜，图片标尺长度为20μm。 2 结果 2.1 用4%甲醛固定法的H1299细胞骨架形态观察 用4%甲醛固定的H1299细胞，进行荧光标记后，微管结构隐约可见，层次不清晰，且细胞胞浆中非特异荧光较强，整个图片的背景噪声较高(图1A）；微丝呈现清晰的束状纤维，层次清晰，立体感较强(图1B）；图像叠加之后的两种荧光有窜色现象，微管和微丝共定位不清晰，2种