芳香烃化合物的微生物降解及基因工程菌的构建环境工程专业论文.docxVIP

摘 摘 要 本研究以苯酚为唯一的碳源和能源从农药厂活性污泥和煤气厂污水排放口周围的 土壤中分离到三株降解能力较好的革兰氏阴性的芳香烃降解菌，分别命名为ZD 2、ZD 4—1和ZD 4-3。通过细菌的16S rDNA序列比对分析以及相关形态学和生理生化特性分 析，将ZD 2、ZD4．1和ZD4—3三株菌分别鉴定属于多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)和铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)。基于16S rDNA序列的系统分类研究表明，菌株ZD4．1和 ZD4—3分别属于两个不同的分类亚组。 研究了Sphingobacterium multivorum ZD 2对五氯酚(PCP)的共代澍降解。结果表 明，苯酚作为生长底物对细菌的生长有一定的抑制作用，PCP共代谢降解效率低。以葡 萄糖为生长底物时PCP降解效果更好，当葡萄糖的量能够满足细菌的生长以及提供降 解PCP所需的还原性物质的量时，则生长底物不再是PCP降解的限制性因素，继续增 加葡萄糖不能促进PCP的降解，葡萄糖和PCP之间不存在底物的竞争性抑制现象。蛋 白质电泳结果表明，葡萄糖为生长底物时，PCP的降解酶是由非生长底物PCP本身所 诱导，它们不同于细菌利用葡萄糖的酶。GC—MS分析PCP共代谢降解中间产物结果表 明，在好氧降解情况一F，PCP的共代谢降解可能也存在渐次脱氯生成苯酚并最终被矿化 的过程。 以菌株Comamonas testosteroni ZD4．1和Pseudomonas aerugi加sd ZD4—3为材料，研 究了它们对芳香烃化合物的降解机理。结果表明，ZD4一l和ZD4—3分别利用邻苯二酚 l，2．双加氧酶催化的邻裂途径和邻苯二酚2，3一双加氧酶催化的间裂途径降解苯酚。邻苯 二酚1，2和2，3．双加氧酶都是可诱导的双加氧酶，其活性强烈的依赖于其降解底物的出 现。细菌ZD4—3中的问裂途径对苯酚的降解效率要高于菌株ZD4—1的邻裂途径，但是 后者降解苯酚的适宜pH值范围以及对芳香烃化合物利用的基质谱范围宽于前者。 通过质粒消除、PCR扩增以及Southern杂交等方法将Pseudomonas aerugionas ZD4—3中的邻苯二酚2，3一双加氧酶基因(pheB)定位于细菌染色体上。采用PCR扩增 的方法从ZD4．3菌中克隆得到大小为0．9kb左右的pheB基因。测序结果表明，∞e岔基 因全长924bp，编码由307个氨基酸组成的邻苯二酚2，3．双加氧酶。利用表达载体pET22b 因全长924bp，编码由307个氨基酸组成的邻苯二酚2，3．双加氧酶。利用表达载体pET22b (+)对pheB进行了表达，酶活性检测结果表明，大肠杆菌粗酶提取液中的酶活性为 3．5617U／mg蛋白质，明显高于野生菌ZD4—3中的酶活性。 为了解pheB基因编码的邻苯二酚2,3．双加氧酶序列与功能之间的关系，利用生物 信息学软件对其结构与功能进行了分析。在GenBank中搜索得到相关的11个外二元醇 双加氧酶的序列，用Bioedit软件进行同源比对分析发现，在全序列中共有12个氨基酸 同源区域，它们主要分布在氨基酸的C，末端和N．末端，而且甘氨酸同源的几率出现较 多。根据对己知的外二元醇双加氧酶的晶体结构分析推断，外二元醇双加氧酶的Gly．3l、 His．157、Leu．184很可能是形成酶的催化活性中心结构域，而C一末端和N一末端的保守 序列可能是酶的结构域形成中心。催化单环芳烃裂解的双加氧酶和催化双环芳烃裂解的 双加氧酶之间的同源性比值较低，遗传距离上较远，它们之间存在明显的差别，而常温 性的C230与耐热的C230在氨基酸同源性方面没有显示出明显的差别。 为了方便基因工程菌监测，将邻苯二酚2，3．双加氧酶基因pheB和绿色荧光蛋白编 码基因efp融合后同时导入到受体菌中。采用一种不需要限制核酸酶和连接酶的新方法 ——“三引物PCR一步法”(TP—PCR)将pheB基因和肋基因融合，构建得至T]fpg融 合蛋白基因。测序结果表明，fag基因的5’端为pheB基因序列，3’端为gfp基因序列， 中间为柔性肽段-GlyaSerI的序列，符合预期结果。为验证融合蛋白基因的功能，对fPg 基因在E．coli中进行了表达实验。结果表明，蛋白质电泳出现大小约64KD的蛋白条带、 荧光显微镜检测到细菌发出的绿色荧光，IPTG诱导后检测到破碎上清液中邻苯二酚2，3． 双加氧酶酶活性为3．2224U／mg蛋白。以上结果说明，fpg基因得到了表达，表达的融 合蛋白具有绿色荧光蛋白和邻苯二酚2，3．双加氧酶的活性。这为将fPg基因导入野生菌 中构建到芳香烃降解