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DNA片段分离回收常用方法.ppt
实验五 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段 质粒DNA的连接和转化 第一部分 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 ——玻璃奶法分离回收琼脂糖凝胶 中DNA片段 实验目的: 掌握利用玻璃奶法从琼脂糖凝胶中分离回收DNA片段的原理和操作技术; 了解其他几种方法的原理与操作技术。 DNA片段分离回收常用方法: 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法 玻璃奶法 电洗脱法 将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中,通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相。 回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。 低熔点琼脂糖凝胶法 将切好的回收胶块放在回收胶槽内,在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶,待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。 待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后,在长波紫外灯下切下含有所需DNA带的凝胶条,置于新的EP管中,加300 μL TE。 65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。 酚氯仿抽提DNA,乙醇沉淀。 DEAE滤膜插片法 将DEAE纤维素膜裁成小条活化处理。 电泳后在目的条带前切一刀,将比条带略宽的DEAE纤维素膜插入切口,不留气泡,继续电泳一会儿,条带上的DNA被膜片截留。 取出膜片冲洗后转移到离心管中加缓冲液65度保温洗脱,直到膜上没有DNA了,将溶液用酚氯仿抽提沉淀。 这个方法不适合做较大的DNA,因为洗脱比较困难。 玻璃奶法 实验原理: 玻璃奶(Glassmilk):无毒、无味、无腐蚀作用的白色硅颗粒,能专一性结合0.2kb至50kb大小的DNA(双链、单链、线性、环状或超螺旋),不结合RNA、蛋白质、寡核苷酸、有机溶剂、去污剂及其他可能抑制酶活性的有机或无机物。 DNA与玻璃奶结合原理:在高盐状态下,玻璃奶周围的负电荷被打破,并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合。在低盐(H2O/1×TE)时溶解分离。 DNA 结合率影响因素: 盐浓度: DNA100bp:高盐状态下结合率高。 DNA100bp:低盐状态下结合率高。 pH值: pH7.0:结合率高。 应 用: 从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA片段; 从DNA反应物中纯化目的DNA片段,如回收纯化PCR产物、酶切连接反应中的DNA片段; 从探针制备反应中去除未标记上的核苷酸以及小的DNA片段(比如引物); DNA浓缩,去盐及去除杂质。 本方法的优点: 高纯度:回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白质及其它有机分子,可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等; 简便:所需主要仪器是一架台式离心机; 快速:整个回收过程只需半个小时; 高效:回收效率达到70%以上; 多用途:可以用于胶回收、PCR产物回收、DNA片段及探针的纯化浓缩等; 安全:不接触苯酚、氯仿等有害物质。 实验材料: 使用Omega bio-Tek胶回收试剂盒(Ultra-Sep Gel Extraction Kit) Ultra-Sep Binding Buffer 300ml Ultra-Sep Beads 5.5ml DNA Wash Buffer 2×80ml Elution Buffer 60ml 超纯水 无水乙醇 方法和步骤: 1.琼脂糖/EB凝胶电泳分离DNA片段。 2.紫外灯下切取所要的DNA条带。 3.将切下胶块放入1.5ml EP管中,称重,以确定胶条的体积。 设定胶的密度为1g/ml,例如0.2g胶认为其体积为0.2ml。 4.加入等体积的Ultra-Sep Binding Buffer。 对长度低于400bp的DNA片段或大于2%琼脂糖凝胶,加入3×体积的Binding Buffer。 5.涡旋震荡悬浮Ultra-Sep Beads,加入10 μl Ultra-Sep Beads到样品EP管中。50~55℃温育10min或时间至完全熔解。在温浴过程中,每隔2 min震荡EP管悬浮Ultra-Sep Beads。注意观察胶完全熔解后胶/ Binding Buffer混合物的pH值。当混合物pH>8.0则DNA的产量将会显著减少。如果混合物变为橙色或红色,则加入5 μl 5M NaAC(pH5.2)以降低pH值。加入NaAC后混合物的颜色应该变为淡黄色。 6.10,000×g室温离心1min,使Ultra-Sep Beads沉淀,弃上清。 7.加入300 μl Ultra-Sep Binding Buffer,涡旋震荡Ultr
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