基因工程-第9章-外源基因表达1.ppt

第九章 外源基因的表达 基因表达(gene expression)就是指某一基因指导下的蛋白质合成，蛋白质是基因表达的产物。 克隆基因表达方面的研究成果，对于某些研究领域有着重要的用途。首先，它有可能为揭示蛋白质结构与功能之间的关系提供新的研究手段。例如，运用重组DNA技术，能够获得可在大肠杆菌细胞中进行有效表达的杂种干扰素的编码基因。这样，便可以将这种蛋白质分子纯化出来，在体外进行生物学方面的研究。  利用基因工程技术将真核基因转至原核生物中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用传统和常规方法不能或难以大量生产的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”来生产就方便得多。例如生长激素释放抑制因子从50万只羊脑中仅能提取出5mg，而现在用10L的工程菌液即能提出来。用720kg猪胰脏只能够提取出100mg胰岛素，而用2000L工程菌发酵液即可得到同样量的胰岛素。从这些例子中可以看到基因工程在应用方面的巨大潜力。  9.1 外源基因在原核细胞中的表达 9.1.1 原核生物基因表达的特点 同所有的生命过程一样，外源基因在原核细胞中的表达包括两个主要过程：即DNA转录成mRNA和mRNA翻译成蛋白质。与真核细胞相比，原核细胞的表达有以下特点： ①原核生物只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 ②原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动子 (promotor)及其他有调控功能的部位。  ③由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。 ④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 ⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 ⑥在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序列，即S-D序列，而真核基因则缺乏此序列。 欲将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和S-D序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：①通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；②外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA(genomic DNA)；③必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达；④外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame)；⑤利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。  9.1.2 基因表达的调控序列 如上所述，由于原核和真核细胞中基因表达的机制是不同的，因此必须详细了解基因表达过程中的各种调控因子，构建高效的表达载体，才能达到高效率、高水平表达外源基因的目的。对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。 1. 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。 原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。 Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。 -35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为，-35区是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点。当σ亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶的核心酶(core enzyme，无σ亚基的RNA聚合酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒，并与之接触，而一旦它们相互结合之后，σ亚基就从最左边的识别位点上解离下来。  (1)lac启动子 lac启动子是来自大肠杆菌的乳糖操纵子。lac操纵子模型最初由Jacob和Monod于1961年提出，它是DNA分子上一段有方向的核苷酸顺序，即由阻遏蛋白基因，(