肺炎链球菌psaa抗原及其在结合疫苗中的应用微生物学专业论文.docxVIP

＼渊1必恻】{|j|必 ＼渊1必恻】{|j|必Y1 909738 苏州大学学位论文使用授权声明 本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， 即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸 质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献 信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、 中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子 文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索。 涉密论文口 本学位论文属 雇——年一月解密后适用本规定。 非涉密论文囹 论文作者签名：导师签名：乏吼日期：蝉堑．J，美 日 期：丝!f：生：!f 肺炎链球菌PsaA抗原及】￡曲：结合疫苗中的心用 肺炎链球菌PsaA抗原及】￡曲：结合疫苗中的心用 中文摘爱 中文摘要 作为一种自然界广泛存在的致病菌，肺炎链球菌可引起肺炎、脑膜炎、中耳 炎、鼻窦炎和败血症等疾病。过去认为肺炎链球菌荚膜多糖抗原为肺炎链球菌主 要致病因子，近年来，随着对肺炎链球菌致病机制的深入研究，发现肺炎链球菌 一些自身蛋白可能为肺炎链球菌致病因子，这些蛋白在所有临床分离的肺炎链球 茵菌株中均存在，可产生交叉免疫保护作用，而且蛋白疫苗产生的是T细胞依赖性 免疫反应，对成人和儿童均有很好的保护作用。将肺炎球菌自身蛋白作为载体与 多糖偶联制备蛋白多糖结合疫苗成为现在肺炎球菌疫苗的主要方向。目的：应用 基因工程技术在原核E co厅和真核毕赤酵母GSll5两种体系中表达和制备肺炎链球 菌表面黏附素A(pne啪ococcal surf．ace adhesin A，PsaA)，并与细菌荚膜多糖偶联 制备成多糖蛋白结合疫苗，探讨Ps诅作为肺炎球菌蛋白载体在结合疫苗中起到增 强其它细菌多糖抗原免疫原性的同时，还能获得抗肺炎球菌的抗体反应，从而达 到用一种结合疫苗能诱导出针对两种细菌的抗体免疫反应的目的。方法：从肺炎 链球菌基因组中扩增删A基因，将目的基因分别插入原核表达载体pET-28“+)和真 核表达载体pPIC9K，获得非融合表达的重组质粒pET28a删和pPIC9K删，通 过转化分别进入大肠杆菌BL21和毕赤酵母GSll5中，分别经IPTG和甲醇诱导，同 采用DEAE．阴离子交换层析法纯化基因重组rPsaA蛋白。经过比较，将表达纯化较 好的rPsaA蛋白与A群脑膜炎荚膜多糖(Group A Menin90coccal PolysaCcharide， GAMP)偶联成多糖蛋白结合疫苗后，用小鼠动物模型进行免疫实验，检测该疫苗 的免疫原性，用ELISA法测定该疫苗在小鼠体内产生的针对肺炎球菌和脑膜炎球菌 两种病原菌特异性抗原的抗体水平。结果：在原核E∞，f中成功克隆基因重组表 达质粒，而且表达的PsaA蛋白在载体上的组氨酸标签之前终止表达，不带有组氨 酸标签，保证疫苗的安全性。SDS．PAGE技术分析表明：rPsaA蛋白高效表达，约 为菌体蛋白的60％，蛋白分子量约为37 l①，而且蛋白的可溶性好，不形成包涵体， 用DEAE．阴离子交换层析法纯化其纯度可达80％以上。纯化到的PsaA蛋白与GAMP 多糖偶联成功，应用于小鼠免疫实验，Ps认蛋白载体能显著增强A群脑膜炎英膜多 糖抗原的免疫原性，并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的 中文摘要 中文摘要 肺炎链球菌PsaA抗原及其在结合疫苗中的应用 特异性抗体。另外在真核毕赤酵母中也成功表达了rPsaA蛋白，目的蛋白表达量高 达90％，纯度约70％。结论：利用基因工程技术在原核表达体系和真核毕赤酵母体 系中均成功获得无组氨酸标签的rPsaA蛋白，并将它与A群脑膜炎荚膜多糖成功偶 联，应用于小鼠免疫实验，在小鼠体内PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多 糖抗原的免疫原性，并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的 特异性抗体，提高疫苗的免疫保护效果。为探讨给儿童接种一种疫苗能同时预防 肺炎和脑膜炎两种传染病的可能性提供研究基础。 ， 关键词：肺炎链球菌表面黏附素A；A群脑膜炎荚膜多糖；多糖蛋白结合疫苗； 两价疫苗；毕赤酵母 作 者：樊小英 指导教师：朱越雄 李忠明 H ：!堡￡!坠垒里!鎏竺21塑兰丝2竺丝丝竺2翌!丝竺!坐垒里业!型12翌竺!￡竺堡!旦竺竺!!!!翌兰!尘竖坐!!堑!!璺! ：!堡￡!坠垒里!鎏竺21塑兰丝2竺