肠道病毒71型和柯萨奇病毒a组16型环介导等温扩增检测方法的建立和应用卫生毒理学专业论文.docxVIP

中文摘 中文摘 英文摘 研究论 引 第一部 丹lJ 材 结 附 附 讨 小 参 第二部 刚 材 结 附 附表 4 9 讨论 5 O 小结 5 1 参考文献 5 2 结论 54 综述 肠道病毒7l型和柯萨奇病毒A组16型检测方法研究进展 55 致谢 65 个人简历 66 中文摘要肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型环介导等温扩增 中文摘要 肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型环介导等温扩增 检测方法的建立和应用 摘 要 手足口病是儿童中常见的肠道病毒感染性疾病，肠道病毒71型 (EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CoxAl6)是其主要病原。手足口病的 传染主要通过粪．口和口．口途径，其中接触感染者粪便污染的水、食物及 土壤可以导致粪一口传播。水是生命之源，由于干净安全饮用水的缺乏， 世界上每年都有大量人群发生疾病和死亡。近年来，EV71的流行在亚太 地区呈上升趋势，甚至引起严重中枢感染或死亡，引起人们的密切关注。 传统的检测手足口病病原的方法通常需要5—7d才能完成，而且操作繁琐、 灵敏度较低，不能满足临床上快速、灵敏的检测需要。因此，建立粪便及 饮用水源水中手足口病病原快速、灵敏的检验方法，对疾病的预防和辅助 检测、评估水源卫生质量和环境卫生状况具有重要的实用价值和现实意 义。 一 =一f一 目的： 建立并优化EV71和CoxAl6的L舢汩检测体系，应用于手足口病的 病原检测。建立EV71和CoxAl6的实时RT．L—6山癣检测方法并定量检测 天津市饮用水源水样品。 方法： 1本研究基于EV71和CoxAl6病毒基因组VPl区利用软件设计出L黼 反应的外引物和内引物。并对反应温度、镁离子浓度、甜菜碱浓度、dNTPs 浓度等扩增条件进行优化。L脚反应的总反应体系为25皿，EV71和 CoxAl6反应混合物分别在62℃和63℃孵育60min，然后在80℃加热10min 终止反应。L舢心反应结束后通过以下几种方法判断扩增是否发生：一是 肉眼观察反应管的混浊度或向反应管中加入SYBR研een I型染料后观察 反应管颜色的变化，二是通过琼脂糖凝胶电泳检测，此外也可通过酶切鉴 定L—6山口扩增产物。对6株肠道病毒分别进行了L砧唧反应来验证引物 的特异性，构建EV7 1和CoxAl6标准质粒模板，梯度稀释后验证L砧唧 反应的灵敏性。 中文摘要2采集60例天津地区手足口病流行期间手足口病患儿的粪便标本，分别 中文摘要 2采集60例天津地区手足口病流行期间手足口病患儿的粪便标本，分别 用EV71和CoxAl6的特异性引物对分离到的病毒RNA进行LAMP及PCR 检测。 3本研究于2010年1月至201 0年11月，采集1 8个天津市饮用水源水样 品。用超滤离心管浓缩500 H正水样，提取总I矾A。实时RT-L剐旧分别 检测饮用水源水中的EV71和CoxAl6。 结果： 1该方法对EV71和CoxAl6的检测有高度的特异性，与甲型肝炎病毒、 脊髓灰质炎病毒、柯萨奇B3、柯萨奇B5、埃可30及柯萨奇A16／肠道病 毒71型等病毒均无交叉反应。L触衄检测CoxAl6的灵敏性比传统的PCR 检测方法高loo倍，检测EV71的灵敏性比传统的PCR检测方法高lO倍。 2 L脚检测EV71的检出率(31／60=51．7％)高于PCR(27／60=45％)， L脚检测CoxAl6的检出率与PCR相当(27／60=45％)。说明这次手足 口病流行的主要病原是EV7l，同时存在CoxAl6的散发。通过两种方法 的比较，可知L—6山口比PCR更快速、灵敏，有着更为广泛的发展前景。 3超滤离心管浓缩病毒的回收率为34．83％。浊度仪实时RT-L触岬结果显 示，天津市饮用水源水中的EV71／CoxAl6病毒浓度大约分别为O至 1．9×106 copies‘L’1和O至5．4×105 copies·L一。 结论： 本研究建立的L』6