睾丸特异表达蛋白spag8的性质和功能研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

中国协和医科大学博士学位论文 中国协和医科大学博士学位论文 中文摘要 中文摘要 SPAG8基因(由人类基因命名数据库命名，也称为HSD．1基因)是我们实验室 利用不孕妇女患者的血清筛选人睾丸凡gtll eDNA表达型文库而获得的～个新基 因，其GenBank接受号为U12978。原位杂交实验显示SPAG8基因位于人类第9 号染色体的短臂上。由7个外显子和6个内含子组成的SPAG8基因，在mRNA 水平上存在多种剪切方式。其中最长的eDNA含有2482个碱基，编码一个由523 个氨基酸组成的蛋白质。多组织Northern blot分析显示SPAG8基因仅仅在睾丸 组织中特异高表达。以SPAG8蛋白的C端序列作为诱饵，筛选人睾丸eDNA表 达文库，获得3个与SPAG8蛋白可能存在相互作用的有意义克隆，分别是HHari (conjugating E2一binding protein)蛋白，ACT(human activator of CREM in teszis)蛋白和RanBPM(Ran binding protein in microtubule organizing center)蛋白。 在实验室已有工作的基础上，本论文着重对SPAG8蛋白的性质和功能进行了 探讨。 对SPAG8蛋白性质研究时，发现该蛋白在细胞的空间分布和发育时间上均具 有一定的特点。首先无论是在高表达外源SPAG8蛋白的CHO细胞中，还是在表 达内源SPAG8蛋白的小鼠生精细胞中，该蛋白的亚细胞定位是动念变化的，即存 在多样性。同时细胞中的SPAG8蛋白通过核孔进行着持续不断的细胞核与细胞质 之间的穿梭过程，其中的出细胞核过程受因子CRMl分子介导并可以被特异性抑 制剂LMB所抑制。其次内源性表达的sPAG8蛋自在生精细胞中的动态分布与发 育时间具有密切的联系：表现在SPAG8蛋白在精母细胞的细胞核和细胞质中均有 分布，而当细胞发育到成熟精子细胞时期，该蛋白则完全不再定位于细胞核中， 而是分布在细胞的顶体和尾部区域。利用金标免疫电镜的方法，我们成功的捕捉 到一个正经过核孔复合物而进行细胞核与细胞质问运输的SPAG8蛋白，从而在更 微观的条件下证明了SPAG8蛋白在细胞中的动态分布特性。 SPAG8蛋白在生精细胞中的表达具有时间或阶段特异性：表现为SPAG8蛋 白从精母细胞时期开始表达直至最后的成熟精子细胞，而在精原细胞中则不表达。 SPAG8蛋白在时间和空间上表达的特点决定了其功能的特点。 中国协和医科大学博士学位论文 中国协和医科大学博士学位论文 中文摘壁 SPAG8蛋白在细胞中的分布与微管之间存在密切关系：当用破坏微管结构的 药物Noeodazole和colchicine处理细胞后发现SPAG8蛋白在细胞中的位置分布 发生很大的变化，由正常状态下的均匀弥散分布改变成许多不规则的大颗粒点状 凝聚物。进一步的免疫共沉淀实验表明在细胞的分裂期，SPAG8蛋白与微管之间 存在直接的相互作用。 在对SPAG8蛋白性质了解的基础上，我们对该蛋白的功能进行了探讨。首先 对酵母双杂交实验获得的与SPAG8蛋白相互作用的两个阳性克隆(ACT蛋白与 HHari蛋白)进行体外和体内实验验证。ACT蛋白与HHari蛋白经原核表达及纯化 之后，我们制备了相应的兔源抗ACT蛋白多克隆抗体和鼠源抗HHari蛋白多克隆 抗体。然后利用体外GST pul卜down实验和免疫共沉淀实验以及相应的 Western．blot检测和银染检测方法分别验证了SPAG8蛋白与ACT蛋白之间，以及 SPAG8蛋白与HHari蛋白之间的相互作用。结果表明在ACT蛋白和SPAG8蛋白 之削存在真正的相互作用，而HHari蛋白表明可能只是一个假阳性信号。 将SPAG8基因和ACT基因分别构建于pEGFP—Cl和pDsRed—Nl载体中，同转染 CHO细胞，发现两个蛋白质在CHO细胞中呈现良好的共定位现象。而当用 Nocodazole等药物处理细胞之后，在SPAG8蛋白的分布被破坏而形成不规则点状 颗粒分伟的同时，ACT蛋白的分布也形成类似的现象，然而两个蛋白质之间依然 存在相互作用，共同形成凝聚的大颗粒。在证明2个蛋白质相互作用的同时说明 两个蛋白质的分布与微管之间具有密切关系。 采用Mercury pathway system和PathDetect回in ViVO Signal Transduction Pathway顺式系统我们分别观察了在CHO细胞，293T细胞和HeLa细胞中SPAG8 蛋白对ACT蛋白和CREM蛋白所介导的基因转录调控的影响。实验结果初步表明在 上述体细胞中SPAG8蛋白没有参与CREM蛋白所介导的CRE通路的转录激活过程。 表明SPAG8蛋白与ACT蛋白之间的相互作用可能发生