表达hbv外膜主蛋白大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性分析病原生物学专业论文.docxVIP

博士论文：表达I-IBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关精毒的构建及其免疫原性研究表达I-IBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的 博士论文：表达I-IBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关精毒的构建及其免疫原性研究 表达I-IBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的 构建及其免疫原性研究 博士研究生胡贵方 导师 俞守义教授 吴小兵副研究员 指导老师 陈清 教授 聂军 教授 中文摘要 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus．HBV)感染引起的严重威 胁人类健康的传染性疾病，目前全球范围内大约有超过3．5亿人受到HBV危害。 大约有15～40％的HBV感染者最终会发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)、肝硬化和肝衰竭。我国是乙型肝炎主要的流行区，现患慢性乙型肝炎的 病人已突破1000万。迄今为止，慢性乙型肝炎的治疗仍无良策，因此，研制新 型HBV疫苗和寻求有效的治疗乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重组腺相关病毒 (adeno．associated virus type 2．rAAV-2)作为一种大有希望的基因转移载体，因 能有效转导多种组织和细胞而引起了人们的高度重视。为此，本研究以研制新型 HBV疫苗为目的，构建了表达HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2，初步 研究了其免疫原性，并探讨了表达I-IBV抗原基因的rAAV-2用于以树突状细胞 (dendritic cell，DC)为基础的慢性乙型肝炎免疫治疗的可行性。 采用PCR法从PTHBV—l质粒中扩增HBV(ayw亚型)外膜主蛋白 (I-IBsAg)、大蛋白(LHBsAg)基因；将PCR扩增产物插入rAAV-2表达质粒 pSNAV中，构建重组质粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg：用脂质体转染的 方法将重组质粒转入BHK--21细胞中，G418筛选得到转入重组质粒并能表达目 的基因细胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg；用具有rAAV包装功能的重组单纯 疱疹病毒(HSVl．rc／AUL2)感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg，纯化后得到 rAAV-2一HBsAg和rAAV-2．LI-msAg；用高效液相色谱仪(HPLC)检测和SDS一 聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)检测了rAAV-2一HBsAg和rAAV-2一LHBsAg 的纯度：以点杂交方法检测重组病毒的物理滴度；ELISA检测混合细胞系 博士论文：表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究BHK—HBsAg和BHK—LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表达，rAAV-HBsAg和 博士论文：表达HBV外膜主蛋白、大蛋白的重组腺相关病毒的构建及其免疫原性研究 BHK—HBsAg和BHK—LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表达，rAAV-HBsAg和 rAAV-LHBsAg在BHK一21细胞和293细胞中的表达。结果表明，HPLC分析显 示主峰为总面积大于99％；SDS—PAGE电泳结果显示3条特征性条带，其间的 杂蛋白量非常少；点杂交检测rAAV-2-HBsAg和rAAV-2．LHBsAg的物理滴度分 别为5×10“和2×10“virus particleslml(vp／m1)；混合细胞株BHK-HBsAg中 I-msAg的表达量为28．6±6．7 ng／5×10。cells，BHK-LHBsAg中HBsAg的表达量 为15．4±5．8 ng／5×10。cells；rAAV-2．[-msAg和rAAV-2一LHBsAg感染BHK一21 细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达，表达量随感染复数(mulfiplicity of infection，MOI)的增加而升高。提示我们已经获得了高滴度、高纯度、在体外能 有效地感染培养细胞的rAAV-2一HBsAg和rAAV-2一LHBsAg，为下一步工作奠定 了基础。 本文首次报道了rAAV-2载体介导HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通 过肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲给药途径，我们观察了rAAV-2-HBsAg 和rAAV-2．LHBsAg在小鼠体内的转导效率和诱导小鼠产生HBV抗原特异性的体 液和细胞免疫反应的能力。结果显示，rAAV-2-HBsAg和rAAV-2．LHBsAg通过 肌肉注射、尾静脉注射、腹腔注射和胃饲途径进入小鼠体内后能有效表达HBsAg， 同一给药途径，rAAV-2一}msAg和rAAV-2一LHBsAg在小鼠体内HBsAg的表达水 平无明显差异(p0．05)；同一重组病毒(rA．AV-2一[-毋sng或rAAV．2-LHBsAg) 不同给药途径之间HBsAg的表达水平亦无明显差异(p0．05)。重组病毒通过不